喇燕菲，肖丽梅，黄 涵，张进忠，孙明艳，王 翊*

(1.广西农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007；2.广西大学林学院，广西 南宁 530004)

【研究意义】培育长花期金花茶组植物品种群一直以来均为金花茶组植物优良品种选育的重要目标和方向。目前金花茶组植物共有18个种，其中，金花茶[Camelliapetelotii(Merrill) Sealy]是世界上著名的观赏品种之一，仅在冬季开花(花期在当年12月至次年1月)；四季金花茶(C.perpetuaS. Y. Liang et L. D. Huang)具有一年多次开花的优良特性，已成为培育四季开花山茶新品种的优良亲本，为长花期金花茶育种提供了更多可能性[1]；淡黄金花茶(C.flavidaChang)是较少见的夏季开花山茶品种。金花茶虽在冬季开花，但在夏季已完成花芽分化[2]；四季金花茶一年四季均可完成花芽分化，但在冬季花芽分化数量相对较少；淡黄金花茶在夏季完成花芽分化后即开始花器官发育，短期内即可开花。可见，金花茶、四季金花茶和淡黄金花茶具有不同的开花特性，但原因至今尚不清楚。因此，分析该3种金花茶组植物的花芽分化特征，对金花茶组植物品种的长花期育种具有重要意义。【前人研究进展】花芽分化是一个复杂的形态建成过程，同时也是花器官形成的关键阶段[3]。目前关于山茶属花芽分化的研究多集中于茶树[C.sinensis(L.) O. Ktze.][4]、油茶(C.oleiferaAbel.)[5-8]和少数山茶园艺品种[9-10。符喆[9]研究发现，耐冬山茶除存在单花芽和叶芽外，还具有能同时分化多个花芽和叶芽的混合芽。张军莉等[11]研究认为，植物花芽分化可分为分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期5个时期。王湘南等[12]研究表明，油茶雌雄蕊原基同时突起，即雌雄蕊同步出现，子房与花药随后形成，因此将油茶花芽分化过程分为花芽前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房与花药形成期和雌雄蕊成熟期6个时期。张鹏等[13]研究显示，光照有利于高州油茶花芽提早分化，且花的外部形态可直观反映内部结构的变化情况。温玥[14]、蔡娅等[15]研究表明，外源激素赤霉素和多效唑均可提高不同油茶品种的花芽分化率和油茶产量。罗帅[16]研究发现，增施适量氮、磷和钾肥也有利于油茶进行花芽分化。有关山茶属植物花芽分化的研究已涉及形态学特征、激素影响和环境因子影响等方面，但关于金花茶组植物花芽分化的研究较少。唐健民等[17]研究显示，东兴金花茶的花芽分化始于12月下旬，整个分化时期持续1个多月，花芽分化的顺序是由外至内，分为花芽未分化期、花芽分化始期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期6个时期，各时期依次发生，且花芽分化期具有重叠现象。【本研究切入点】目前，针对单次开花金花茶、多次开花四季金花茶和夏季开花淡黄金花茶花芽分化特性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对金花茶、四季金花茶和淡黄金花茶的花芽分化过程进行动态拍摄，解剖观察其不同分化阶段花芽的形态学特征，并利用改良石蜡切片技术观察花芽分化不同时期的结构，确定该3种金花茶组植物花芽分化所需时间，明确其花芽分化过程的差异，为金花茶组植物品种的长花期育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年5-12月在广西大学热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室和广西大学林学院植物制片室进行。选取南宁市金花茶基因库中生长良好、无病虫害发生的四季金花茶、淡黄金花茶和金花茶成年植株各5株，采集其一年生枝条或当年生新梢上的花芽为试验材料。金花茶和淡黄金花茶花芽采样时间均为2018年5-8月，四季金花茶花芽采样时间为2018年3、6和9月，3种金花茶均各采样3次，每次连续采样1个月；每隔3～4 d收集花芽1次，每次每种金花茶采集花芽5～6枚保存于FAA固定液中。

1.2 花芽分化物候期及解剖观察

于2018年5-9月，在上述选定3种金花茶植株的各方位分别选取5根生长健壮的一年生枝条，每隔3～4 d用照相机对生长的花芽进行拍摄，记录物候期。花芽解剖在蔡司体视显微镜(德国SteREO Discovery.V12)下进行，花芽外部大小用ZEN(Blue edition V1.0)测量。其中，横径为花芽最宽处的宽度，纵径为花芽顶部至基部的距离。每种金花茶每个发育阶段解剖观察花芽数不少于15个。

1.3 花芽石蜡切片

参照肖丽梅[18]的方法进行花芽石蜡切片，主要步骤如下：材料经固定、软化，酒精梯度脱水，TO透明剂(主要成分为优质松节油[19])透明，石蜡浸蜡，再进行包埋；采用Leica DM 2016切片机制作8.0 μm厚切片，然后粘片、复水、0.05 %甲苯胺蓝(Solarbio，G3668)染色，中性树胶封片。在蔡司显微镜(德国Axio Imager 2)下选择结构完整高清的切片进行拍摄。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2019进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 3种金花茶的开花特性

物候观测发现，金花茶于10月底萌发抽梢，翌年大部分花芽着生于新梢长成的一年生枝条上，花芽分化时间为5-8月，期间花芽连续分化，同一植株不同枝条花芽分化不同步。9月后花芽分化基本完成，处于孕蕾阶段，该阶段花器官逐步发育直至翌年1月中上旬花朵开放；四季金花茶四季均可进行花芽分化，4-6月和9月两次花芽分化比较集中，其中，4-6月分化的花芽数较多，9月分化的花芽数较少，而每年11月至翌年2月仅偶尔可见零星花芽分化；淡黄金花茶花芽分化较整齐，5月开始分化，花朵8月开放，偶尔有少量花芽分化滞后，可在秋冬季节见零星花朵开放。从图1可看出，金花茶花芽从5月10日开始分化，至7月16日分化完成，持续66 d，此后进入花器官发育(孕蕾)阶段，直至花朵开放；四季金花茶从6月1日开始分化，至6月29日分化完成，持续30 d，从现蕾至开放为90 d；淡黄金花茶从5月2日开始分化，至6月15日分化完成，持续43 d，从现蕾至开放107 d。

2.2 3种金花茶花芽的外部形态

金花茶、四季金花茶和淡黄金花茶花芽分化各时期的外部形态、大小和解剖观察结果如图2所示。根据花芽解剖统计数据，横径和纵径可直观反映花芽大小，但花芽横径大小可较准确地反映花芽分化所处时期。由表1可知，当金花茶花芽横径生长至2.3 mm时启动花芽分化，生长至3.4 mm时进入雄蕊分化时期，雌雄蕊分化通常同步进行，当横径生长至5.0 mm时进入子房形成期，预示花芽分化即将完成；当四季金花茶和淡黄金花茶花芽横径生长至约1.5 mm时启动花芽分化，生长至2.4 mm时进入雄蕊分化时期，生长至3.9和4.7 mm时进入子房分化期。

2.3 3种金花茶花芽分化的形态特征

根据3种金花茶花芽的形态特点(图2～3)，可将其花芽分化时期划分为未分化期、分化初期、苞片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7个时期。

2.3.1 未分化期 在花芽未分化期，3种金花茶的营养生长锥体积较小(图3-A1、图3-B1和图3-C1)，此时芽生长点的顶端分生组织(Sam)细胞较小、排列紧密，随着营养生长锥进一步分化，其形态也有所变化，但从外观和解剖结构进行观察，都较难区分该阶段的芽是叶芽还是花芽。

2.3.2 分化初期 进入花芽分化初期，花芽呈圆桃形，先端钝，花芽形态较小，但已可从外观上将花芽和叶芽区别开(图2-A1、图2-C1和图2-E1)。石蜡切片结果显示，该阶段3种金花茶的花芽分化情形相似，均为生长锥明显变宽，呈半圆形，基部膨大，形成染色较深的生殖生长锥，进而发育为花原基(图3-A2、图3-B2和图3-C2)，且花原基两侧出现较肥厚的萼片原基。

2.3.3 萼片分化期 该阶段花芽外观形态多呈椭圆型，外有鳞片包被(图2-A2、图2-C2和图2-E2)。其中，金花茶花芽大小为3.250 mm(横径)×3.925 mm(纵径)，四季金花茶和淡黄金花茶的花芽略小(表1)。解剖观察发现，该阶段的生长锥下陷、变宽，逐渐趋于扁平，生长点周围已分化出花萼原基，并逐渐将生长点覆盖(图2-B2、图2-D2和图2-F2)。石蜡切片结果显示，生长锥由半圆缓慢变宽变平，中间为中央分生组织，两侧苞片原基迅速分化(图3-A3、图3-B3和图3-C3)；在四季金花茶和淡黄金花茶花芽中央分生组织的两侧可观察到两个突起(图3-A3和图3-B3)，为花瓣原基，而此阶段金花茶的花芽中未出现花瓣原基。

分化阶段Differentiation stage纵横径Vertical and horizontal diameter形态大小(mm) Shape size金花茶C. petelotii四季金花茶C. perpetua淡黄金花茶C. flavida分化初期横径2.699±0.3141.738±0.2251.880±0.381纵径3.230±0.4472.246±0.3982.391±0.282萼片形成期横径3.250±0.1612.043±0.1222.370±0.376纵径3.925±0.4002.498±0.2912.712±0.401花瓣形成期横径3.516±0.3452.274±0.1562.640±0.203纵径4.492±0.7922.733±0.4113.140±0.374雄蕊分化期横径3.920±0.5222.419±0.0462.911±0.235纵径4.492±0.7923.193±0.1983.762±0.602雌蕊分化期横径4.636±0.2913.343±0.3323.421±0.563纵径5.393±0.6753.673±0.4934.071±0.822子房形成期横径5.177±0.1004.437±0.5645.122±0.431纵径5.406±0.4074.409±0.9575.870±0.514

2.3.4 花瓣分化期 该阶段花芽继续生长，呈椭圆形(图2-A3、图2-C3和图2-E3)。其中，金花茶花芽大小为3.516 mm×4.492 mm，四季金花茶花芽大小为2.274 mm×2.733 mm，淡黄金花茶的花芽比四季金花茶的花芽稍大(表1)。解剖观察发现，花芽中央的生殖锥明显变宽变凹，生殖锥周围已分化出花瓣原基(图2-B3、图2-D3和图2-F3)。石蜡切片结果显示，该阶段生殖锥继续加宽；随着分化进程的进行，花瓣原基逐渐形成并向上伸展(图3-A4、图3-B4和图3-C4)。其中，四季金花茶和淡黄金花茶花芽中央的分生组织区出现很多小突起(图3-A4和图3-B4中*所示处)，为雄蕊原基，该处细胞排列紧密、有规则，而此阶段金花茶的花芽中未出现雄蕊原基。

2.3.5 雄蕊分化期 该阶段花芽继续膨大，形状近圆球形(图2-A4、图2-C4和图2-E4)。解剖观察发现，花瓣原基形成后在其内侧逐渐分化出雄蕊原基。其中，四季金花茶雄蕊原基和雌蕊原基的分化几乎同步进行，而金花茶和淡黄金花茶分化形成多列雄蕊原基后才观察到雌蕊原基分化(图2-B4、图2-D4和图2-F4)。石蜡切片结果显示，该阶段的生殖锥继续加宽，部分略微凹陷，其上出现雄蕊原基，随着雄蕊原基的分化，最终形成排列有序的雄蕊群。雄蕊群细胞分裂旺盛，染色较深(图3-A5、图3-B5和图3-C5)，其中，金花茶和淡黄金花茶花芽中央的分生组织仍不断分化出雄蕊原基，而四季金花茶花芽中央的分生组织已经出现雌蕊原基(图3-A5中★所示处)。

2.3.6 雌蕊分化期 该阶段花芽继续膨大，其中四季金花茶花芽明显变大(图2-A5)，从雄蕊形成期的2.419 mm×3.193 mm增至3.343 mm×3.673 mm(表1)。解剖观察发现，该阶段3种金花茶的雄蕊已经分化完成，雌蕊正在分化(图2-B5、图2-D5和图2-F5)。石蜡切片结果显示，生殖锥的中央缓慢向上凸起，形成心皮原基，心皮原基在分化过程中继续生长逐渐长高、加宽，且各心皮联合形成子房腔。从图3-B6和图3-C6还可看出，淡黄金花茶和金花茶的心皮原基在分化过程中其边缘生长迅速而互相愈合，并继续向内卷曲生长(图3-C6)直达中心部分，从而形成一个具有3和5室子房的雌蕊[20]，而四季金花茶在心皮快速分化的同时，中央轴的分化同步进行，最后形成子房(图3-A6)，分化速度快于金花茶和淡黄金花茶。

2.3.7 子房形成期 进入子房形成期预示着花器官分化即将完成。该阶段3种金花茶的花芽均呈球形，被多层鳞片(图2-A6、图2-C6和图2-E6)。解剖观察发现，雄蕊群已分化完成，子房也相对完整(图2-B6、图2-D6和图2-F6)。石蜡切片结果显示，随着雌蕊原基伸长，上部合拢形成柱头，下部为花柱，花柱逐渐膨大，形成子房(图3-A7、图3-B7和图3-C7)，其中四季金花茶在子房发育的同时形成中轴座，并在中轴座上分化出胚珠原基。

3 讨 论

本研究中，同为两性花植物的金花茶、四季金花茶和淡黄金花茶在花芽分化过程中雄蕊发育均略早于雌蕊，但后期基本同步，与韦霄等[2]对金花茶的研究结果相似，这也是金花茶组植物在杂交育种中无需套袋而进行异花授粉的原因。

本研究通过物候观测结合花芽解剖观察，发现冬季开花的金花茶花芽分化持续时间为66 d，夏季开花的淡黄金花茶花芽分化持续时间为43 d，而四季均可开花的四季金花茶花芽分化持续时间最短，仅30 d，3种金花茶的花芽分化持续时间存在较大差异，可能与其在不同季节开花的品种特性有关，与陈政等[21]研究认为梅树早花品种花芽分化持续时间较短、晚花品种花芽分化持续时间较长的观点相似；3种金花茶组植物花芽分化所需时间均与茶树[4]、油茶[5]、东兴金花茶[17]和杜鹃红山茶(Camelliaazalea)[22]相近，但明显较观赏山茶(Camelliaspp.)[9-10]短；金花茶的花器官发育(孕蕾)约需8个月，四季金花茶和淡黄金花茶花器官发育(孕蕾)均约需2个月，三者的孕蕾时间总体上均较长，是否存在休眠现象需进一步探究。

已有研究表明，通过观察花芽外部形态可确定花芽分化阶段，如薄壳山核桃(Caryaillinoensis)和香港四照花(Dendrobenthamiahongkongensis)的外部形态与花芽内部分化所处阶段联系较紧密，这类植物可根据花芽的外部形态特征推测其花芽分化状况[23-24]。但也有很多植物花芽的外部形态与内部分化阶段联系不紧密，如簕杜鹃(Bougainvilleaspectabilis)花芽分化前期外观形态变化不明显，不能直观反映其内部的结构变化，而后期分化速度加快，芽体变化明显，又能从芽体的外部形态判断花芽分化进程[25]。本研究中，3种金花茶组植物花芽分化过程中花芽的外部形态并无典型区别，仅花芽的大小变化较明显，其横径与花芽分化所处阶段密切相关，即随着花芽分化的进行，花芽的横径逐渐增大，因此可根据花芽横径大小判断花芽所处分化阶段，而根据纵径大小判断发育阶段容易造成误判(如金花茶花瓣形成期的花芽纵径为4.492 mm，雌蕊形成期的纵径也为4.492 mm)，与朱雯等[26]发现广宁红花油茶花芽的横径纵径比变化特征与不同分化期存在一定的对应联系，但整体上是先由大变小、再变大的研究结果存在差异，推测与广宁红花油茶花芽的纵径变化不规律有关。

本研究将3种金花茶组植物花芽分化过程划分为未分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7个时期，与何春燕[27]对普通油茶的划分结果一致；3种金花茶组植物的花芽在花瓣形成期、雄蕊形成期和雌蕊形成期或多或少具有重叠分化现象，与张逸[4]对茶树的观察结果相似；解剖可观察到3种金花茶组植物雌蕊和雄蕊分化及以后的分化阶段重叠进行，石蜡切片结果则显示四季金花茶花芽分化阶段重叠现象较另外两种金花茶明显，萼片分化、花瓣分化、雄蕊分化和雌蕊分化阶段均与其他分化阶段同步进行，且在子房形成过程中可同步形成中轴座，并分化形成胚珠，这在另两种金花茶中未有发现；3种金花茶组植物花芽分化速度不同，其中四季金花茶的花芽分化速度较快，是否与花芽中成花基因的相对表达量较高有关尚待进一步探讨。

韦霄等[2]研究发现，金花茶花朵开放后花药即已成熟，柱头同时分泌粘液，但在开花后2 d内花药便失去散粉能力。本研究对3种金花茶组植物花芽分化过程的形态学和开花日期观测结果表明，四季金花茶、金花茶和淡黄金花茶花朵分别在花芽分化完成(花芽横径约5.00、5.27和5.55 mm)后约2个月、8个月和2个月开放。因此，在金花茶组植物杂交育种尤其是大量群体杂交育种的工作中，应提前做好杂交准备，以免耽误最佳授粉日期。

4 结 论

金花茶、四季金花茶和淡黄金花茶的开花习性存在明显差异，但花芽分化过程相似；四季金花茶的萼片分化与花瓣分化、花瓣分化与雄蕊分化等阶段可同步进行，重叠分化现象较其他两种金花茶更明显，可作为金花茶类植物育种、园林应用及开花调控机制研究的参考依据。