董伟清，江 文，何芳练*，邱祖杨，蒋慧萍，黄诗宇，刘莉莉，何春红，杨干德

(1.广西农业科学院生物技术研究所，广西 南宁 530007；2. 荔浦市农业农村局，广西 荔浦 546600)

【研究意义】荸荠[Eleocharisdulcis(N. L. Burman) Trinius ex Henschel]为莎草科多年生浅水草本植物，球茎质脆多汁，主要营养物质为碳水化合物，淀粉是其主要储藏形式，但在不同品种中差异较明显[1-2]。植物淀粉生物合成受ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SSs)、淀粉分支酶(SBEs)和脱分支酶(DBEs)的关键基因调控[3]，其中AGPase是淀粉生物合成的起始酶和限速酶，其活性直接影响淀粉合成的速率[4]。但迄今关于荸荠AGPase的基因序列和结构等分子生物学特性及其在球茎发育过程中的表达情况尚不明确。因此，克隆荸荠AGPase的基因并对其结构和表达情况进行分析，对研究荸荠淀粉生物合成机制及培育高淀粉荸荠品种具有重要意义。【前人研究进展】高等植物的AGPase是一个异源四聚体(α2β2)，由2个大亚基和2个小亚基构成，大亚基偏重于对酶活性的构象进行调节，小亚基行使AGPase的催化功能[5]。已有研究表明，编码AGPase的基因表达与淀粉合成速率一致，在淀粉合成中发挥重要作用[6-8]。Beyene等[9]通过转基因沉默木薯AGPase大亚基基因(MeAPL3)，发现木薯贮藏根的淀粉和干物质含量显著降低，叶柄/茎角增加，叶片下垂。宋波涛等[10]将sAGP基因导入马铃薯，明确了该基因能提高马铃薯块茎淀粉含量。Cheng等[11]通过莲藕AGPase大亚基基因的多态性开发FMAGPL-I1功能标记，发现含有362 bp片段的40个荷花品种总淀粉含量较少，为提高莲藕淀粉含量的分子标记辅助选育效率提供了依据。【本研究的切入点】目前，针对荸荠淀粉生物合成的研究仅见通过对叶片和球茎等组织的高通量测序获得涉及淀粉生物合成相关基因的报道[12-14]，鲜见关于荸荠AGPase的基因克隆、基因序列及其结构等分子生物学特性分析，以及EdAPS1基因在球茎发育过程中表达情况的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆荸荠编码AGPase小亚基基因(EdAPS1)的cDNA序列，对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR检测EdAPS1基因在不同荸荠组织和球茎发育过程中的表达情况，为探究荸荠淀粉生物合成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试荸荠为地方品种桂林马蹄，2019年7月下旬种植于广西桂林市荔浦市修仁镇念村示范基地。根据荸荠球茎发育时期，分别于移栽大田后90、100、110和120 d进行地上部和地下部取样，其中，地上部取叶状茎，地下部取球茎、匍匐茎和根，洗干净备用。每次取样约2.0 g，共取样4次，3次重复。每次取样后立即用液氮速冻，最后将速冻样品置于-80 ℃贮存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取与cDNA合成 参照天根生化科技(北京)有限公司的植物多糖多酚总RNA提取试剂盒说明，分别从荸荠移栽后不同时期的球茎及移栽后120 d的各组织样品中提取总RNA。根据天根生化科技(北京)有限公司TIANScript II cDNA第一链合成试剂盒说明，将提取的总RNA反转录成cDNA第一链。

1.2.2EdAPS1基因克隆 以荸荠球茎cDNA为模板，根据荸荠转录组测序获得EdAPS1基因的注释信息，设计特异克隆引物EdAPS1-F(5′-ACTCTCATTCATTCTCTCTCTC-3′)和EdAPS1-R(5′-TATGGCACTGAACCGAGCAAAC-3′)。PCR反应体系20.0 μl：5×Phusion HF Buffer 4.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.4 μl，正、反向引物(10 μmol/L)各1.0 μl，Phusion DNA Polymerase(2 U/μl)0.2 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O补至20.0 μl。扩增程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳检测。采用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit将目的片段连接到pEASY-Blunt载体上，然后转化Trans1-T1感受态细胞，涂布在含100 mg/L Amp的LB平板上。挑取单克隆，以M13正向和反向引物进行PCR阳性检测，将阳性克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。

1.2.3EdAPS1基因生物信息学分析 利用NCBI的开放阅读框(ORF)查找器(ORFfinder)在线工具查找分析EdAPS1基因cDNA序列的ORF；氨基酸序列的同源性比较采用DNAMAN 9完成；采用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)和SignalP工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测分析EdAPS1蛋白的理化性质和信号肽；利用NCBI的CD-search在线工具进行EdAPS1蛋白功能结构域分析；利用SMART在线数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行EdAPS1蛋白结构域预测分析；利用PredictPro(https://www.predictprotein.org/home)在线预测EdAPS1蛋白的二级结构；利用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)预测EdAPS1蛋白的三级结构；最后运用MEGA 5.1的邻近相接法(NJ)构建系统发育进化树。

1.2.4 基因表达分析 根据获得的荸荠EdAPS1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0设计荧光定量PCR引物EdAPS2-F(5′-GCAGGCGACCACTTATACAGGA-3′)和EdAPS2-R(5′-TGGGCTTCTCGGCAAACTCAA-3′)，以荸荠18S rRNA(GenBank登录号：MG742686.1)为模板设计荧光定量PCR内参引物CWC1-F(5′-TTGACGGAAGGGCACCACCA-3′)和CWC1-R(5′-TCGCTCCACCAACTAAGAACGG-3′)。荧光定量PCR参照南京诺唯赞生物科技有限公司的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明操作。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行45个循环。每个样品设3次重复。利用2-△△Ct方法计算荸荠EdAPS1基因在球茎不同发育期和不同组织中的相对表达量[15]。

2 结果与分析

2.1 荸荠总RNA提取及EdAPS1基因的克隆结果

将提取的荸荠叶片和球茎总RNA进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，28S rRNA和18S rRNA条带明亮清晰(图1)，说明所提取的RNA完整性较好，可用于后续的RT-PCR扩增试验。

以荸荠球茎总RNA反转录所得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到长度为1716 bp的目的基因片段(图2)，经连接、转化和菌落PCR鉴定，得到阳性克隆。通过测序获得编码AGPase小亚基基因的cDNA序列，并将其命名为EdAPS1基因，在GenBank公布的登录号为MT127798。

2.2 EdAPS1基因的生物信息学分析

通过NCBI网站的ORFfinder查找分析，EdAPS1基因的cDNA序列包含1个完整的ORF(1521 bp)，编码506个氨基酸(图3)，编码荸荠AGPase的小亚基。预测EdAPS1蛋白分子量为55.67 kD，分子式为C2469H3896N672O746S23，总原子数为7806，等电点为5.98，负电荷残基总数(Asp+Glu)为58，带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为53，不稳定指数为43.56，表明该蛋白不稳定；脂肪指数为88.32，GRAVY平均水平为-0.149，表明该蛋白为亲水性蛋白。利用SignalP工具信号肽预测结果显示，EdAPS1蛋白无信号肽(图4)。在NCBI中预测EdAPS1蛋白的保守结构域，发现该蛋白氨基酸序列第87～506位与磷酸腺苷酰基转移酶(Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)高度相似，说明该蛋白具有相似的功能，属于PLN02241超家族(图5)。根据SMART在线数据库分析结果，EdAPS1蛋白的氨基酸序列第77～352位为NTP_transferase结构域，第447～489位为PbH1结构域(图6)，其中，NTP_transferase结构域具有将核苷酸转移到磷酸糖上的能力；PbH1结构域为平行β-螺旋重复序列，该序列有助于保持蛋白整体稳定，具有该结构域的蛋白通常是以多糖为底物的酶。对EdAPS1蛋白的二级结构和溶剂可及性进行预测，结果(图7)显示其二级结构组成比例为螺旋结构(Helix)占16.21 %，链状结构(Strand)占19.17 %，无规则卷曲(Loop)占64.62 %；溶剂可及性分析结果显示，暴露(Exposed)占32.61 %，埋藏(Buried)占61.26 %，中间型(Intermediate)占6.13 %。EdAPS1蛋白的三级结构由17个α-螺旋、34个β-折叠和52个β-转角构成(图8)。

2.3 EdAPS1蛋白的氨基酸序列同源性比对分析及系统进化树构建

将EdAPS1蛋白的氨基酸序列提交至NCBI进行BLASTp同源性比对，发现EdAPS1蛋白与油莎草(Cyperusesculentusvar.sativus)AGPase小亚基蛋白的同源性最高，一致性为88.69 %。利用DNAMAN 9对11种植物AGPase小亚基蛋白的氨基酸序列进行多重比对，结果(图9)发现不同植物的AGPase小亚基蛋白氨基酸序列具有较高的同源性。其中，荸荠EdAPS1蛋白与油莎草相应蛋白(ALL29329.1)的亲缘关系最近，一致性为86.91 %；与中华猕猴桃(AFO84075.1)、刺毛黧豆(RDX86632.1)、月季花(XP024181373.1)和凤梨(XP020109479.1)等的亲缘关系较远，一致性为68.80 %～79.64 %。

系统进化树分析结果(图10)表明，不同物种AGPase小亚基蛋白主要聚为两大分支，其中，刺毛黧豆(Mucunapruriens)和欧洲油菜(Brassicanapus)等9个物种聚为一类；荸荠与油莎草2个物种聚为一类。荸荠与油莎草均为莎草科植物，二者间进化关系接近，可推测其AGPase小亚基蛋白的生理特性与生态特征在进化过程中具有相似特性。

2.4 EdAPS1基因的表达水平分析

荧光定量PCR结果(图11)显示，EdAPS1基因在荸荠的根、叶状茎、匍匐茎和球茎中均有表达，其中在球茎中表达量最高，其次为叶状茎，二者差异显著(P<0.05，下同)，且均显著高于在根和匍匐茎中的表达量，而在根中的表达量最低，但与在匍匐茎的表达量差异不显著(P>0.05，下同)。从图12可看出，在球茎发育过程中，EdAPS1基因在球茎发育后期(S4，移栽后120 d)的相对表达量最高，且显著高于其他发育时期，在球茎发育前期和中期(S1～S3，移栽90～110 d)的相对表达量差异不显著。而荸荠球茎发育后期为体积迅速增大和干物质含量迅速增加期，因此，推测EdAPS1基因在后期高表达与淀粉的快速积累相关。

3 讨 论

本研究从荸荠中克隆获得编码AGPase小亚基基因EdAPS1的cDNA序列，该序列全长1716 bp，包含1个1521 bp的ORF，编码506个氨基酸；EdAPS1蛋白的分子量为55.67 kD，理论等电点为5.98，具有NTP_transferase和PbH1结构域；二级结构由螺旋结构(16.21 %)、链状结构(19.17 %)和无规则卷曲(64.62 %)组成；三级结构由17个α-螺旋、34个β-折叠和52个β-转角构成；EdAPS1蛋白与其他植物APS蛋白具有较高的同源性，在进化上与油莎草亲缘关系最近；EdAPS1基因表达主要集中于球茎且在球茎发育后期表达量最高。

本研究发现，荸荠EdAPS1蛋白的结构特征和理化性质与马铃薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白等较相似，均具有NTP_transferase和PbH1结构域，推测其与马铃薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白具有相似功能[4，16]，后续可通过转基因技术进一步验证。本研究的系统发育进化树分析结果显示，荸荠EdAPS1蛋白与油莎草中相应蛋白(ALL29329.1)的亲缘关系最近，其中荸荠属于莎草科荸荠属(Eleocharis)植物，油莎草属于莎草科莎草属(Cyperus)植物，说明AGPase小亚基在同科植物的进化过程中趋于保守，与王立等[4]研究认为芋CeAPS1蛋白与紫萍和莲等相应蛋白的相似性在80.00 %以上，具有较高保守性的观点一致。

Siedlecka等[17]将AGPase小亚基基因的启动子转入拟南芥后，能在拟南芥的叶片、茎、花和根等部位驱动GUS基因表达，表明AGPase小亚基基因具有广泛的表达性。本研究荧光定量PCR分析结果与其相似，EdAPS1基因在荸荠球茎、叶状茎、匍匐茎和根中均有表达，但表达量相对集中在球茎，且在球茎发育后期表达量显著提高。根据已有研究结果[18-19]，荸荠球茎在发育后期体积迅速增大，干物质含量迅速增加，薄壁细胞中的淀粉粒大量积累、互相挤压，占据细胞内较多的空间，甚至影响细胞核的形态，说明淀粉积累是影响球茎干物质含量增加的主要因素，推测本研究中荸荠EdAPS1基因在荸荠球茎发育后期表达量显著提高与淀粉积累呈正相关，可作为阐明荸荠淀粉生物合成机制及培育高淀粉荸荠品种的参考依据。后续应加强淀粉代谢通路上相关酶如淀粉合成酶、淀粉分支酶和脱分支酶的基因功能研究，以期能系统地阐明荸荠淀粉合成的分子机制，为高淀粉荸荠分子育种提供参考依据。

4 结 论

从荸荠中克隆获得编码AGPase小亚基基因(EdAPS1)，该基因包含一个1521 bp ORF，编码506个氨基酸；荸荠的EdAPS1基因具有在球茎表达量最高，尤其在球茎发育后期表达量更高，且显著高于球茎其他发育时期的特点。