郭杰坤 方 向 彭小明 曾令国

骨髓间充质干细胞是具有自我更新、分化和增殖能力的多功能干细胞[1]。骨髓间充质干细胞的成骨分化对正常生理条件下的骨发育和病理条件下的骨修复起着重要作用[2]。长链非编码RNAs(lncRNAs)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在基因表达调控中起着重要作用[3]。目前研究发现，lncRNAs能调控骨髓间充质干细胞成骨分化[4-5]。既往的报道表明，lncRNA-CWF19Ll与婴儿早发性小脑共济失调和小脑萎缩有关；发生lncRNA-CWF19L1突变的胎儿发现有单侧六指畸形和脊椎畸形[6-8]。由此提示，lncRNA-CWF19L1可能与成骨分化相关。基于以上背景，在本研究中，我们将探讨lncRNA-CWF19L1影响骨髓间充质干细胞成骨分化的具体机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂：成骨诱导液(HyClone公司)；ALP、BMP2、Smad2及β-actin抗体(abcam公司)；Trizol试剂(Thermo Fisher公司)；RT逆转录试剂盒(Thermo Fisher公司)；荧光定量试剂盒(Takara公司)；海肾荧光素酶载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)；骨髓间充质干细胞、茜红素染色液、碱性磷酸酶检测试剂盒(广州赛业公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 ShRNA的构建、转染与Smad抑制剂

ShRNAs由广州赛哲生物科技合成。相关序列如下：

shRNA-1:

CWF19L1-shRNA-F1：GATCCGGCTTATCTGATGACCATGTTCAAGAGACATGGTCATCAGATAAGCTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R1：AATTCAAAAAAGCTTATCTGA-TGACCATGTCTCTTGAACATGGTCATCAGATAAGCCG。

shRNA-2:

CWF19L1-shRNA-F2：GATCCGGTTGTTCCTATTTCT-ACATTCAAGAGATGTAGAAATAGGAACAACTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R2：AATTCAAAAAAGTTGTTCCTA-TTTCTACATCTCTTGAATGTAGAAATAGGAACAACCG。

阴性对照组序列：

CWF19L1-shRNA-NC-F：GATCCGTTCTCCGAACGT-GTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-TTTTTTG;CWF19L1-shRNA-NC-R：AATTCAAAAAATTCTCCGAAC-GTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAACG。

慢病毒转染严格按照制造商的说明进行。qRT-PCR检测shRNA(lncRNA-CWF19L1-shRNA1)的转染效率。由于MAPK抑制剂SB203580可以阻断TGF-β/Smad通路[9]，我们选择SB203580作为Smad2的抑制剂。

1.2.2 碱性磷酸酶活性测定

根据厂商说明，使用ALP检测试剂盒检测ALP活力。将骨髓间充质干细胞接种于24孔板中，加入成骨诱导液，诱导14 d。将细胞裂解液加入到碱性磷酸酶试剂盒新鲜配制的底物中培养30 min，然后 NaOH停止。使用酶标仪读数，吸光度为405 nm。经过PBS洗涤两次后，将收集的细胞固定10 min，在黑暗环境中使用BCIP/NBT试剂培养30 min后进行ALP染色。

1.2.3 茜素红S(ARS)染色及其定量检测

将骨髓间充质干细胞在成骨培养基培养28 d。用PBS洗涤后，70%冰酒精固定1 h。使用茜红素染色液，37 ℃下对细胞进行染色25 min，然后用PBS清洗两次。在光学显微镜拍摄细胞图像，观察钙化结节并计数[10]。

1.2.4 RNA提取及实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用Trizol提取总细胞总RNA。然后根据试剂盒说明，使用RT逆转录试剂盒对RNA进行逆转录。采用qRT-PCR检测lncRNA-CWF19L1、BMP2、ALP、Runx2、smad2和β-actin的mRNA表达水平。引物序列如下：

lncRNA-CWF19L1, F: 5’-GCGGATTCGCATTCCCAATTT-3’ and R:5’-CTCCACAAGCCAAGAGGCG-3’;

BMP2,F: 5’-AGTTCTGTCCCCAGTGACGAGTTT-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’; ALP, F: 5’-AGATGATGACTCTGAGCCTCCTT-3’ and R: 5’-GATGGGACAGCCTAAACTTGG-3’; Runx2, F: 5’-TTCTCCAACCCACGAATGCAC-3’ and R:5’-CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT-3’；

Smad2, F: 5’-TCACAGTCATCATGAGCTCAAGG-3’ and R:5’-TGTGACGCATGGAAGGTCTCTC-3’；

β-actin, F: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’。

采集CT值，计算2-ΔΔct值，对数据进行定量分析。β-actin作为内参。miR-132-3p的表达量采用标准Taqman MicroRNA分析法(Applied Biosystems)进行测量[11]。RNU48作为内参。

1.2.5 蛋白免疫印迹反应

使用RIPA裂解液在冰上对细胞进行裂解。经过蛋白提取、蛋白浓度测定、电泳、转膜和封闭等步骤后，加入一抗，在4 ℃条件下过夜孵育。然后在37 ℃下，继续二抗体孵育2 h。使用化学发光凝胶成像系统检测蛋白质的相对表达。

1.2.6 双荧光素酶反应

按照制造商的说明进行荧光素酶报告分析。将对照组细胞和实验组细胞接种于96孔板中，转染2 d后收集细胞，清洗，每孔加入100 μL双荧光素酶试剂盒中的细胞裂解液。取20 μL的细胞裂解产物，进行目报告基因萤火虫荧光素酶及内参海肾素荧光素酶检测，计算萤火虫荧光素酶表达值与内参海肾素荧光素酶表达值之间的比值。

1.2.7 统计学分析

数据以平均值±标准差表示，每个实验重复3次。采用SPSS 17.0进行数据统计分析。P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化

建立稳定低表达lncRNA-CWF19L1的骨髓间充质干细胞。图1a所示，与对照组相比，转染组的lncRNA-CWF19L1显著降低。碱性磷酸酶染色表明，低表达lncRNA-CWF19L1的骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d后，形成的钙结节增多；茜红素染色表明，低表达lncRNA-CWF19L1的骨髓间充质干细胞中成骨诱导后21 d，钙化沉淀物显著增加(图1b、1c)。与对照组相比，低表达lncRNA-CWF19L1组的成骨基因BMP2和ALP的蛋白表达水平显著上调(图1d)。以上说明，lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。

注：a为人骨髓间充质干细胞转染lncRNA-CWF19L1-shRNA后，用qRT-PCR检测转染组和对照组的lncRNA-CWF19L1表达量。b为转染组和对照组分别在人骨髓间充质干细胞成骨分化第21天进行茜素红染色(ARS)和第14天进行碱性磷酸酶(ALP)染色。c为转染组和对照组在碱性磷酸酶染色和茜素红染色后的钙化数定量。d为用Western blot法检测转染组和对照组在人骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后，成骨相关基因ALP和BMP2的蛋白表达量。*P<0.05和**P<0.01

2.2 lncRNA-CWF19L1调控miR-132-3p表达

为进一步探讨了lncRNA-CWF19L1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制，建立稳定低表达miR-132-3p和高表达miR-132-3p的骨髓间充质干细胞(见图2a)。通过qRT-PCR检测，相对于对照组，低表达lncRNA-CWF19L1的骨髓间充质干细胞的miR-132-3p表达量显著降低，而高表达lncRNA-CWF19L1的骨髓间充质干细胞的miR-132-3p表达显著升高(见图2b)。根据生物信息学分析(见图2c)，我们构建野生型lncRNA-CWF19L1和突变型lncRNA-CWF19L1荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告结果表明，过表达miR-132-3p能显著提高野生型lncRNA-CWF19L1转染后的荧光素酶活性，而突变型lncRNA-CWF19L1的荧光素酶活性没有变化(见图2d)。以上结果表明lncRNA-CWF19L1直接与miR-132-3p结合，并促进其表达。

注：a为qRT-PCR检测过表达miR-132-3p组、低表达miR-132-3p组及对照组在人骨髓间充质干细胞的miR-132-3p表达量。b为qRT-PCR检测过表达lncRNA-CWF19L组、低表达lncRNA-CWF19L1组及照组在人骨髓间充质干细胞中miR-132-3p的表达量。c为荧光素酶报告载体中lncRNA-CWF19L1(wt，野生型)与(mut，突变型)结合位点序列。d为双荧光素酶报告结果。*P<0.05和**P<0.01

2.3 miR-132-3p通过Smad2调控人骨髓间充质干细胞成骨分化

图3a所示，在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，Smad2的表达持续增高。与对照组相比，过表达miR-132-3p能抑制Smad2的表达，而低表达miR-132-3p能提高Smad2的表达(见图3b)。根据Targetscan预测，Smad2可能是miR-132-3p的下游靶基因(见图3c)。我们建立野生型Smad2 和突变型Smad2 荧光素酶报告载体验证miR-132-3p和Smad2之间的相互作用。转染miR-132-3p过表达载体后，野生型Smad2的荧光素酶活性降低，而突变型Smad2的荧光素酶活性没有变化(见图3d)，以上表明miR-132-3p直接靶向Smad2并抑制其表达。此外，降低Smad2表达能降低成骨基因BMP2和ALP的蛋白表达量，而在低表达Smad2并低表达miR-132-3p的骨髓间充质干细胞中，BMP2和ALP的蛋白表达量有所回升(见图3e)。在茜素红染色和ALP染色中，得到同样的结果(见图3f、3g)。图3e～3g结果表明，低表达miR-132-3p能促进成骨分化，而低表达Smad2则抑制了成骨分化。总之，以上结果表明miR-132-3p直接靶向Smad2抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。

注：a为qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞经过成骨诱导第0、2、4、6、8天Smad2的表达量。b为qRT-PCR检测过表达miR-132-3p组、低表达miR-132-3p组及对照组的中Smad2的表达量。c为荧光素酶报告载体中Smad2(wt，野生型)与(mut，突变型)结合位点序列。d为双荧光素酶报告结果。e为分别构建低表达miR-132-3p组，低表达Smad2组和低表达miR-132-3p+Smad2组，分别检测三组Smad2、BMP2、ALP的表达量。f为上述三组经过成骨诱导14天后的碱性磷酸酶染色图及经过成骨诱导21 d后的茜素红染色图。g为上述三组的碱性磷酸酶染色和茜素红染色后的钙化量。*P<0.05，**P<0.01

2.4 lncRNA-CWF19L1通过miR-132-3p调控smad2抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化

分别构建过表达miR-132-3p组，低表达lncRNA-CWF19L1组，过表达miR-132-3p+低表达lncRNA-CWF19L1组及对照组。低表达lncRNA-CWF19L1可显著提高Smad2的蛋白和mRNA表达水平，而在低表达lncRNA-CWF19L1和过表达miR-132-3p的共同作用下，Smad2的蛋白和mRNA的表达水平有所下降(见图4a、4b)。为了确定lncRNA-CWF19L1和miR-132-3p在调节成骨分化中的协同作用，使用qRT-PCR检测BMP2和ALP的表达水平。如图4c和4d所示，相对于对照组，过表达miR-132-3p能降低BMP2和ALP的表达，但在过表达miR-132-3p和低表达lncRNA-CWF19L1的共同作用下，BMP2和ALP的表达有所回升。以上结果说明，lncRNA-CWF19L1通过调控miR-132-3p，抑制smad2表达，进而抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。

注：分别构建过表达miR-132-3p组，低表达lncRNA-CWF19L1，过表达miR-132-3p+低表达lncRNA-CWF19L1及对照组。a为用western blot检测以上四组的Smad2蛋白表达量。b为用qRT-PCR检测以上四组的Smad2表达水平。c、d为用qRT-PCR分别检测上述4组的BMP2和ALP表达水平。*P<0.05

3 讨论

目前研究发现，lncRNA参与人骨髓间充质干细胞成骨分化。例如，上调lncRNA-MEG3可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[12]，而下调lncRNA-NONHSAT009968可抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化[4]。既往有报道显示，lncRNA-CWF19Ll与小脑疾病、肝脏炎症有关；胎儿的lncRNA-CWF19L1表达异常可致单侧肢体六指畸形和脊椎畸形[6-8]。LncRNA-CWF19Ll可能与成骨分化相关。然而，lncRNA-CWF19L1影响人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制尚未确定。在本项研究中，我们通过降低骨髓间充质干细胞中lncRNA-CWF19L1的表达，发现骨髓间充质干细胞的成骨能力有所增强。由此提示，lncRNA-CWF19L1可影响骨髓间充质干细胞的成骨分化。

已有研究表明miR-132-3p可负性调控骨髓间充质干细胞的成骨分化[13-15]。在本研究中，过表达miR-132-3p可降低人骨髓间充质干细胞Smad2、BMP2和ALP的表达量；而低表达miR-132-3p则促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化，由此证明miR-132-3p是骨髓间充质干细胞成骨分化的负性调控因子[14]。实验中的双荧光素酶结果表明，lncRNA-CWF19L1与miR-132-3p直接相关，过表达miR-132-3p能提高lncRNA-CWF19L1的荧光素酶活性。同时，低表达lncRNA-CWF19L1能降低miR-132-3p的表达量。这些结果表明lncRNA-CWF19L直接与miR-132-3p结合，调控人骨髓间充质干细胞的成骨分化。

目前研究认为骨髓间充质干细胞的成骨分化受多种信号途径调控，包括TGF-β、BMPs、Wnt、MAPK和Hedgehog等[16]；其中TGF-β通路是成骨的重要信号通路之一。Smad2作为是TGF-β信号通路的起始因子，将TGF-β从胞外传递到核内，直接参与TGF-β的信号转导[17-18]。目前有研究表明，Smad2作为miR-132-3p的靶基因，影响MC3T3-E1细胞成骨分化[19]；而抑制Smad2的表达能抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化[20]。在当前研究中，通过TargetScan网站分析，Smad2作为miR-132-3p的下游靶基因，并通过双荧光素酶实验验证了两者间的靶控关系。过表达miR-132-3p能降低Smad2的表达；而抑制了miR-132-3p则增加Smad2表达。同时，低表达Smad2能降低骨髓间充质干细胞中BMP2和ALP的表达量。鉴于我们已经证明miR-132-3p和Smad2对人骨髓间充质干细胞中的调节功能，我们进一步分析发现，低表达lncRNA-CWF19L1可降低miR-132-3p的表达，进而导致Smad2上调，进一步增加BMP2和ALP的表达，从而促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。由此，以上结果阐明了lncRNA-CWF19L1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制。