郭杰坤 方 向 彭小明 曾令国

骨髓间充质干细胞是具有自我更新、分化和增殖能力的多功能干细胞[1]。骨髓间充质干细胞的成骨分化对正常生理条件下的骨发育和病理条件下的骨修复起着重要作用[2]。长链非编码RNAs(lncRNAs)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在基因表达调控中起着重要作用[3]。目前研究发现，lncRNAs能调控骨髓间充质干细胞成骨分化[4-5]。既往的报道表明，lncRNA-CWF19Ll与婴儿早发性小脑共济失调和小脑萎缩有关；发生lncRNA-CWF19L1突变的胎儿发现有单侧六指畸形和脊椎畸形[6-8]。由此提示，lncRNA-CWF19L1可能与成骨分化相关。基于以上背景，在本研究中，我们将探讨lncRNA-CWF19L1影响骨髓间充质干细胞成骨分化的具体机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂：成骨诱导液(HyClone公司)；ALP、BMP2、Smad2及β-actin抗体(abcam公司)；Trizol试剂(Thermo Fisher公司)；RT逆转录试剂盒(Thermo Fisher公司)；荧光定量试剂盒(Takara公司)；海肾荧光素酶载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)；骨髓间充质干细胞、茜红素染色液、碱性磷酸酶检测试剂盒(广州赛业公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 ShRNA的构建、转染与Smad抑制剂

ShRNAs由广州赛哲生物科技合成。相关序列如下：

shRNA-1:

CWF19L1-shRNA-F1：GATCCGGCTTATCTGATGACCATGTTCAAGAGACATGGTCATCAGATAAGCTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R1：AATTCAAAAAAGCTTATCTGA-TGACCATGTCTCTTGAACATGGTCATCAGATAAGCCG。

shRNA-2:

CWF19L1-shRNA-F2：GATCCGGTTGTTCCTATTTCT-ACATTCAAGAGATGTAGAAATAGGAACAACTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R2：AATTCAAAAAAGTTGTTCCTA-TTTCTACATCTCTTGAATGTAGAAATAGGAACAACCG。

阴性对照组序列：

CWF19L1-shRNA-NC-F：GATCCGTTCTCCGAACGT-GTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-TTTTTTG;CWF19L1-shRNA-NC-R：AATTCAAAAAATTCTCCGAAC-GTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAACG。

慢病毒转染严格按照制造商的说明进行。qRT-PCR检测shRNA(lncRNA-CWF19L1-shRNA1)的转染效率。由于MAPK抑制剂SB203580可以阻断TGF-β/Smad通路[9]，我们选择SB203580作为Smad2的抑制剂。

1.2.2 碱性磷酸酶活性测定

根据厂商说明，使用ALP检测试剂盒检测ALP活力。将骨髓间充质干细胞接种于24孔板中，加入成骨诱导液，诱导14 d。将细胞裂解液加入到碱性磷酸酶试剂盒新鲜配制的底物中培养30 min，然后 NaOH停止。使用酶标仪读数，吸光度为405 nm。……