程 艺 ， 马 超 ， 陈晓雨 ， 邵钰晨 ， 王 潇 ，杨雪丽 ， 苏 蓉 ， 李婷婷 *

（1. 江苏海洋大学 江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室， 江苏 连云港 222005； 2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005）

限制性核酸内切酶（简称“限制酶”）是现代基因工程中最基础的一大类工具酶[1]。 天然来源的限制酶往往具有星号活性（即在非理想条件下限制酶的专一性发生改变）较强、反应缓冲体系不一致等缺陷，所以研究者对限制酶的研究和改造一直没有停止[2]。 不同限制酶之间的序列同源性很低，基本无法通过同源序列分析来确定核心催化位点，因此解析限制酶蛋白质的三维结构和阐明限制酶的分子机制对后续定向改造具有重要的指导意义[3-4]。 然而，尽管目前已经发现了数千种限制酶，被商业化应用的限制酶也达到300 种左右，但迄今为止仅有50 余种限制酶的三维结构得到解析[5-8]。

大多数限制酶蛋白质相对分子质量小于70 000，适合采用X 射线晶体衍射法解析三维结构[9-10]。 由于限制酶具有切割DNA 的特性， 在对其进行重组表达时往往会使宿主DNA 被切割， 造成宿主菌的死亡，因此需要利用该限制酶对应的甲基化酶对宿主DNA 进行保护， 从而获得重组限制酶的大量表达[11]。 另一方面，由于限制酶彼此之间序列同源性低，无法参考已有的限制酶晶体结构，使用分子置换法来推算晶体衍射的相位，只能采用同晶置换法或反常散射法[12]。 同晶置换法需要制备大量蛋白质晶体来摸索制备重原子衍生物的浸泡条件。……