黄文波 范舒舒 马占忠 汪成 李文丽 张思

(1. 汕头大学医学院附属粤北人民医院 生殖医学中心，广东 韶关 512026；2. 汕头大学医学院附属粤北人民医院 检验科、产前诊断中心，广东 韶关 512026)

不孕不育严重影响人类的生殖健康和家庭、社会的稳定，成为全球关注的问题。据统计，大约20%的育龄夫妇患有生育障碍，其中男方因素占50%，而弱精症是影响男性生育力的常见病因[1]。精子活力是衡量精液质量和男性生育力的重要指标。根据WHO诊断标准，将精子活力分为3个等级：PR为前向运动精子，NP为非前向运动精子，IM为静止精子。若PR+NP<40%或PR<32%诊断为弱精症[2]。从分子水平分析，精子活力与线粒体有关，因为线粒体作为细胞的“能量工厂”，通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，为精子的生成、分化和运动提供能量，一旦精子线粒体基因突变就有可能使精子活力下降，导致男性不育[3]。本研究采用高通量基因测序技术对弱精症患者的精子进行线粒体基因组测序，探讨线粒体基因突变与弱精症的相关性，为弱精症的基因诊断和选择辅助生殖方式提供新的途径和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年3月至2020年10月在粤北人民医院生殖医学中心就诊的46例弱精症患者和精液常规正常的健康男性40例。弱精症患者排除性腺功能低下、睾丸炎史、输精管梗阻、精索静脉曲张后，根据WHO关于弱精症的诊断标准，经 CASA 软件分析，PR+NP<40%或PR<32%的弱精症患者为研究组，平均年龄(33.07±6.14)岁；精液参数正常的40名健康男性为对照组，平均年龄(32.33±6.00)岁。两组年龄差异无统计学意义。本试验经本院伦理委员会讨论通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器 CFT-9201 CASA精子分析系统(江苏瑞祺生命科学仪器有限公司)、德国IMPLEN N50 Touch超微量分光光度仪、GeneTouch TC-EA基因扩增仪、BIORAD CFX96荧光定量PCR仪、Nextseq 500测序仪(Illumina)、DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)和Q800R 超声破碎仪(Qsonica)等。

1.2.2 样本采集 受检者禁欲 3～7d，通过手淫法采集精液样本不少于 1.5ml，用无菌杯收集，送检过程保持容器温度 20℃～37℃。样本 37℃水浴60min内液化后进行检测。

1.2.3 提取精子线粒体DNA 将液化后的精液缓慢加入45%和 90%的SpermGrad(vitilife公司)梯度分离液中，300g离心20min；弃上清，精子沉淀用3ml SpermRinse洗涤，300g离心5min，弃上清液；将精子沉淀物用德国QIAamp DNA Mini Kit试剂提取精子线粒体DNA；用德国IMPLEN N50 Touch超微量分光光度仪测定DNA浓度。

1.2.4 构建文库、高通量基因测序 将提取的线粒体DNA经过长片段扩增后得到16.6kb PCR产物；……