王虎斌,黄卫胤,温玉发,孙 玲,陈 爽,乔红群

(1.南京工业大学 江苏省药物研究所 安全性评价中心,江苏 南京 211800;2.南京工业大学 药学院,江苏 南京 211800)

1995年美国食品药品管理局(FDA)首次提出的生物药剂学分类系统(BCS),是根据药物在胃肠道中的溶解性和药物通过肠道膜的渗透性对药物进行分类的框架[1]。2016年国家市场监督管理总局基于BCS分类颁发了《人体生物等效性试验豁免指导原则》,该原则应用于仿制药物申请人体生物利用度和生物等效性实验豁免[2]。根据药物的溶解性和渗透性,药物在BCS分类下有四类:Ⅰ类(高溶解性-高渗透性)、Ⅱ类(低溶解性-高渗透性)、Ⅲ类(高溶解性-低渗透性)、Ⅳ类(低溶解性-低渗透性)[3]。当口服固体制剂具有很高的溶解度,且在体内的溶出时间比胃排空时间短时,药物在体内的吸收就不会依赖药物的溶出时间和在胃肠道内的停留时间。对于高溶解性的药物,若药物的吸收不被处方中辅料显著影响,可免去药物的人体生物利用度和生物等效性实验,即满足人体生物等效性实验豁免的条件。

拉米夫定为核苷类似物,是乙型肝炎病毒的治疗药物,同时也可联合齐多夫定用于治疗艾滋病[4-6]。口服后其体内的活性代谢物——拉米夫定三磷酸盐作为逆转录酶的竞争性抑制剂,会影响乙型肝炎病毒DNA的复制,引起链终止[7-8]。拉米夫定对人体DNA聚合酶的亲和力很低,因此不干扰人体正常的DNA合成[9-10]。拉米夫定在体内有良好的吸收,据报道其口服生物利用度超过80%,且药动力学特征呈现线性动力学过程,只有5%～10%的拉米夫定被代谢为无药理活性的反式亚砜代谢物,70%左右的拉米夫定以原形式通过肾脏消除,在肝脏中的代谢很少[11-13]。拉米夫定溶解性高,若能通过合理的实验研究其渗透性,得到其肠道渗透性数据,则可以判断其是否满足生物等效性豁免[14]的条件。

在研究化合物肠道渗透性的诸多模型中,在体单向肠灌流模型保留了肠道神经和转运蛋白的完整性、血液及淋巴液的供应,较接近机体内的状态[15]。该模型简单、准确,可用于预测肠道对药物的吸收[16]。笔者使用在体单向肠灌流模型研究拉米夫定在大鼠肠道内的渗透性,判定拉米夫定的BCS类别并为其申请人体生物等效性豁免提供有效、可靠的渗透性数据支撑。

1 实验

1.1 药品与试剂

拉米夫定(批号为DBH010G-B15B-171003,纯度为99.8%),由福建广生堂药业股份有限公司提供;拉米夫定对照品(批号为101007-20150,纯度为99.7%)、苯妥英钠对照品(批号为100210-201303,纯度为99.9%)和阿昔洛韦对照品(批号为100121-201104,纯度为99.8%),购自中国食品药品检定研究院;人工小肠液(批号为0706A18)和人工胃液(批号为0920A18),购自北京雷根生物公司;水为自制超纯水;其余试剂皆为分析纯。

1.2 动物

无特定病原体级(SPF)SD大鼠30只,雌雄各半，体质量大于300 g,由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证号为SCXK(浙)2018-0001,合格证号为1806130011。动物依据体质量随机分为5组,分别为苯妥英钠对照组,阿昔洛韦对照组和拉米夫定高、中、低3个剂量组,每组6只,雌雄各半。

实验大鼠在适应性饲养期一周期间自由进食、饮水。本实验通过江苏省药物安全性评价中心实验动物中心动物伦理委员会的批准。

1.3 仪器

LC-15C型高效液相色谱仪(HPLC)、SPD-15C检测器,日本Shimadzu公司;BT100SV2-CE型蠕动泵,保定雷弗流体科技有限公司;F3JN77433型超净水机,美国Millipore公司;XS105型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;5424型高速离心机,Eppendorf(中国)有限公司;基本型涡旋混合器,美国Talboys公司。

1.4 溶液的配制

1.4.1 Krebs-Ringer’s(K-R)溶液的配制

依次取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.32 g、葡萄糖1.40 g、MgCl20.02 g、NaHCO31.37 g,置于1 L超纯水中溶解,用H3PO4调节pH至6.8(每次临用时现配)。

1.4.2 空白灌流液的制备

取1.4.1节中配制的K-R溶液,经大鼠肠道灌流后,离心取上清液,即得空白灌流液。

1.4.3 拉米夫定标准储备液的配制

精密称取拉米夫定对照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇与水(体积比为1∶1)溶解并定容,得到1 mg/mL的拉米夫定标准储备液,冷藏于冰箱(4 ℃)中备用。

1.4.4 标准曲线系列溶液的配制

取1.4.3节配制的储备液适量,用空白灌流液稀释至拉米夫定质量浓度为0.25、0.5、1、2.5、5、10和25 μg/mL的系列溶液,即为标准曲线系列溶液。

1.4.5 含药灌流液的配制

精密称取拉米夫定供试品300 mg,置于250 mL容量瓶中,加适量K-R溶液使其完全溶解后定容,得到拉米夫定质量浓度为1 200 μg/mL的含药灌流液,作为灌流的高剂量组,再分别稀释10倍和100倍后作为灌流的中(120 μg/mL)、低(12 μg/mL)剂量组。

精密称取苯妥英钠7.5 mg,置于250 mL量瓶中,加适量K-R溶液,振荡使其溶解后,再加K-R溶液稀释至刻度,制成含苯妥英钠30 μg/mL的灌肠溶液。

精密称取阿昔洛韦12 mg,置于100 mL量瓶中,加适量K-R溶液,振荡使其溶解后,再加K-R溶液稀释至刻度,制成含阿昔洛韦120 μg/mL的灌肠溶液。

1.5 检测条件

检测拉米夫定的色谱柱为Xterra MS C18型柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),流动相为25 mmol/L醋酸铵-甲醇缓冲溶液(用冰醋酸调节pH至3.8,醋酸铵与甲醇的体积比为85∶15),流速为0.15 mL/min,进样体积为10 μL,柱温为室温,检测波长为277 nm。

检测苯妥英钠的色谱柱为Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为20 mmol/L KH2PO4-乙腈缓冲溶液(用H3PO4调节pH至2.5,KH2PO4与乙腈体积比为60∶40),检测波长为220 nm,流速为1.0 mL/min,进样体积为10 μL,柱温为室温。

检测阿昔洛韦的色谱柱为Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(体积比为10∶90),检测波长为254 nm,流速为1.0 mL/min,进样体积为10 μL,柱温为室温。

1.6 大鼠在体单向肠灌流实验[17-18]

1.6.1 大鼠在体单向肠灌流模型的建立

实验前取禁食12 h但不禁水的SD大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)麻醉后沿腹中线切口4 cm，打开腹腔,在肠道两端插硅胶管,用灭菌的手术线固定,近心端作为灌流入口,远端作为出口。实验时，用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿,于红外灯下使大鼠保持正常体温。先用37 ℃等渗生理盐水冲洗肠内容物直至出口处溶液变清澈,然后用预热至37 ℃的含药灌流液进行灌流,灌流速率为0.2 mL/min,预平衡30 min后,入口处用已知质量的装有含药灌流液的小瓶进行灌流,在出口处用另一已知质量的小瓶收集灌流液(每隔20 min为一个灌流时间点,同时迅速更换下一个已知质量的含药灌流液小瓶和收集液小瓶),称量后计算灌入和收集的药液质量,灌流时间持续至110 min。灌流结束后麻醉处死大鼠并测量灌流肠道的长度(l)和内径(r)。

1.6.2 模型验证

采用高渗透性模型药品(苯妥英钠对照品)与低渗透性模型药品(阿昔洛韦对照品)在所建模型上进行在体吸收参数的测定,在与高、低渗透性药物的吸收参数作比较后,若发现两者实验数据符合要求,说明已建模成功。

1.6.3 拉米夫定大鼠在体单向肠灌流实验

按1.6.1节方法进行拉米夫定高、中、低3个剂量组大鼠在体单向肠灌流实验,灌流时间持续至110 min。

1.7 大鼠肠道灌流样品的处理

取适量大鼠肠灌流样品,以转速16 000 r/min离心2 min后,取上清液,低剂量组直接进样分析,中、高剂量组分别稀释10倍和100倍后进样分析。

1.8 数据处理

(1)

(2)

(3)

式中:Q为肠道灌流的流速(0.2 mL/min)。

2 结果与讨论

2.1 拉米夫定分析方法的验证结果

2.1.1 专属性

分别取空白灌流液、对照样品(空白灌流液中添加10 μg/mL拉米夫定)和拉米夫定灌流样品(10 μg/mL拉米夫定大鼠灌流液)进样分析,HPLC图谱见图1。由图1可知:在实验条件下,拉米夫定的保留时间为5.785 min,空白灌流液在拉米夫定出峰处未检出杂峰,分析方法特异性良好。

图1 拉米夫定的HPLC图谱Fig.1 HPLC spectra of lamivudine

2.1.2 线性关系

取标准曲线系列样品进样分析,记录HPLC图谱,以拉米夫定的色谱峰面积为纵坐标(y)、拉米夫定的质量浓度为横坐标(x),进行线性回归运算,得到标准曲线的回归方程为y=204 501x+8 297.1(相关系数R2=0.999 9),拉米夫定质量浓度的线性范围为0.25～25 μg/mL。

2.1.3 稀释可靠性

取拉米夫定标准储备液,用空白灌流液稀释,配制拉米夫定质量浓度分别为120、1 200 μg/mL的溶液各5份,分别稀释10倍和100倍后进样分析，记录HPLC峰面积,以HPLC峰面积计算拉米夫定质量浓度并计算准确度。得到稀释后的准确度为98%～102%,相对标准偏差(RSD)<1%,表明稀释可靠性符合研究要求。

2.1.4 进样精密度

取拉米夫定标准储备液,用空白灌流液稀释,配制拉米夫定质量浓度为12 μg/mL的样品溶液，连续进样6次,考察进样精密度,HPLC峰面积与保留时间的RSD分别为0.3%和0.1%,表明进样精密度符合研究要求。

2.1.5 精密度与准确度

取拉米夫定标准储备液,用空白灌流液稀释,配制拉米夫定质量浓度分别为2.5、12、20 μg/mL的低、中、高浓度样品溶液,每一浓度样品同日内连续测定5次,把测得的HPLC峰面积代入标准曲线计算得到拉米夫定质量浓度，并计算其RSD以考察批内精密度,同法连续测定3 d以考察批间精密度;配制上述质量浓度样品各5份并进样分析,将样品的HPLC峰面积代入标准曲线中计算拉米夫定质量浓度,以实验浓度与理论浓度的比值计算回收率并作为准确度,结果见表1。批内和批间精密度的RSD均小于2%,得到的回收率为98%～102%,均符合研究要求。

表1 精密度与准确度的实验结果Table 1 Experimental results of precision and accuracy

2.1.6 稳定性

取拉米夫定标准储备液添加至空白灌流液中配制低、中、高浓度样品溶液。拉米夫定在空白灌流液中于室温下放置0、0.5、1、4、8、12和24 h后进样分析,以HPLC峰面积计算拉米夫定的质量浓度,结果见表2。由表2可知:拉米夫定在不同介质和不同考察时间点质量浓度的RSD均小于5%,拉米夫定在空白灌流液中的稳定性良好。

表2 拉米夫定在空白灌流液中的稳定性Table 2 Stability of lamivudine in blank perfusion

2.1.7 拉米夫定在人工胃液和人工肠液中的稳定性

取拉米夫定标准储备液添加至人工胃液和人工肠液中配制低、中、高浓度样品溶液。拉米夫定在人工胃液中的考察时间点为37 ℃下放置0、0.2、1、1.5和2 h;拉米夫定在人工肠液中的考察时间点为37 ℃下放置0、0.83、1.17、1.5、1.83、4、6、8和10 h。以HPLC峰面积计算拉米夫定的质量浓度,结果分别见表3和4。由表3和4可知:拉米夫定在不同介质和不同考察时间点的质量浓度的RSD均小于5%,拉米夫定在人工胃液和人工肠液中的稳定性良好。

表3 拉米夫定在人工胃液中的稳定性Table 3 Stability of lamivudine in artificial gastric juice

表4 拉米夫定在人工肠液中的稳定性Table 4 Stability of lamivudine in artificial intestinal fluid

2.2 对照药物的方法验证结果

对照药物苯妥英钠和阿昔洛韦的验证内容包括专属性、标准曲线、准确度、精密度和灌流液稳定性。对照药物在1.5节所述检测条件下,苯妥英钠的保留时间为4.732 min,阿昔洛韦的保留时间为7.295 min,空白灌流液在对照药物出峰处未检出杂峰,表明色谱方法特异性良好。对照药物在0.25 ～ 25 μg/mL的范围内保持良好的线性关系,苯妥英钠的标准曲线方程为y=19 532x-3 512.2(R2=1.000 0),阿昔洛韦的标准曲线方程为y=35 329x+1 169.8(R2=1.000 0);对应的准确度为98% ～ 101%,RSD均小于1%;对应的灌流液稳定性分别为98.73%和99.88%。验证结果均符合研究要求。

2.3 大鼠在体单向肠灌流模型的验证结果

2.4 拉米夫定大鼠在体单向肠灌流实验结果

表5 拉米夫定在大鼠肠道的吸收参数Table 5 Lamivudine absorption parameters in rat intestine

表6 拉米夫定在不同时间点的吸收参数Table 6 Lamivudine absorption parameters at different time points

拉米夫定片剂单次口服最高剂量为300 mg,溶于250 mL水中后,质量浓度为1 200 μg/mL,因此,笔者选择此质量浓度作为研究拉米夫定肠道吸收的高剂量组浓度,稀释10倍和100倍后分别作为中剂量组和低剂量组。实验结果显示,拉米夫定在大鼠肠道内的吸收参数在各剂量组间无显著性差异。

本实验结果显示拉米夫定的Peff为0.3×10-5～2×10-5cm/s,拉米夫定在肠道内的吸收介于高渗透性和低渗透性之间,属于中渗透性药物,预计其口服固体制剂的人体吸收分数为50%～84%。拉米夫定药动学研究显示其在体内快速吸收且口服的生物利用度大于80%,接近BCSⅠ类药物的边界,本实验中拉米夫定的Peff也接近2×10-5cm/s。根据拉米夫定的溶解性资料,结合本实验结果,拉米夫定属于BCS Ⅲ类化合物[21]。对于活性成分为拉米夫定的仿制制剂,只要处方中的其他辅料成分不显著影响拉米夫定的吸收,就不必证明该拉米夫定在体内生物利用度和生物等效的可能性,即视为满足生物等效性豁免的条件。

3 结论

1)本实验建立的HPLC-UV分析方法，验证专属性、精密度、准确度和稳定性均符合研究要求,可用于灌流样品中拉米夫定的分离检测。

3)不同剂量组拉米夫定在大鼠肠道内及不同灌流时间点的吸收参数间无显著性差异(P>0.05),拉米夫定存在被动扩散的吸收机制。