吴娟 崔冬梅 杨晓 曾骏文

中山大学中山眼科中心 眼科学国家重点实验室，广州 510060

视觉循环也被称为类维生素A循环，是人类视觉的基础。全反式视黄酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是维生素A的代谢产物[1]，对维生素A的代谢是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的主要功能之一[2-3]。RPE细胞也可为光感受器细胞提供营养，维持光感受器外段的日常吞噬作用，使其保持兴奋性并实现自我更新[4-5]。由于光感受器外段的吞噬作用、特殊的解剖位置和高代谢活性，RPE细胞尤其容易受到损害[6]。研究发现，ATRA在RPE细胞内的过度积累可引起细胞毒性并导致细胞凋亡[7-8]，使眼底发生变性疾病。既往研究表明，由ATRA诱导并通过NADPH氧化酶介导的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)参与了光感受器和RPE细胞的变性退化[9]，但关于RPE细胞变性的分子机制仍不清楚。本研究拟探讨ATRA体外诱导ARPE-19细胞凋亡的信号途径，以期为视网膜病变中ATRA的毒性作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

ARPE-19细胞系购自美国ATCC细胞库。DMEM/F12培养基、质量分数0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraadetic acid，EDTA)(美国Gibco公司)；胎牛血清(bovine serum albumin，BSA)、ATRA、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Sigma公司)；青链霉素(100 μg/ml)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK8)(日本Dojindo公司)；膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸盐(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin-V)凋亡试剂盒(美国Becton公司)；Multicaspase分析试剂盒(MCH100109)、ROS检测试剂盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美国Merck Millipore公司);Powerwave XS微孔板分光光度计(美国BioTek公司)；Brilliant SYBR Green试剂盒(日本Takara公司)；引物序列(上海Sangon Biotech公司)；RIPA裂解缓冲液(上海碧云天公司)；兔源caspase 12单克隆抗体(ab62484)、兔源caspase 3单克隆抗体(ab90437)(美国Abcam公司)；兔源caspase 8单克隆抗体(#4790)、兔源caspase 9单克隆抗体(ab669514)、兔源cleaved caspase 3单克隆抗体(#9964)、兔源GAPDH单克隆抗体(#5174)(美国Cell Signaling Technology公司)。……