王 开， 荆得宝， 于素平， 刘雪阳

（海军军医大学附属公利医院口腔科，上海 200135）

炎性衰老的典型表现是牙槽骨丧失导致的牙齿脱落和面型改变。因此，抑制口腔牙周炎症，促使口腔颌骨再生，维持牙齿稳定，成为我们面临的问题。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种异质的基质细胞群，具有自我更新及多向分化的潜能，能生成分化为多种其他细胞系，是现代组织工程研究、基因治疗和细胞免疫替代治疗中的种子细胞，尤其在维持骨吸收和骨形成的骨稳态中具有极其重要的作用[1-2]。

沉默信息调控因子6（Sirt6）是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）的脱乙酰化酶，具有腺二磷酸（adenosine diphosphate,ADP）核糖基转移酶活性，可保护机体免受衰老和疾病的侵袭。此外，Sirt6通过减少活性氧类（reactive oxygen species,ROS）的产生和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的磷酸化，抑制了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的血管外膜成纤维细胞的炎症[3]。过表达Sirt6可通过诱导椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）模型中NP细胞的自噬来抑制NP细胞的衰老和凋亡[4]。本研究采用脂多糖（LPS，10 μg/mL）来诱导大鼠BMSCs的炎症反应，检测Sirt6在炎症大鼠BMSCs中的骨生成作用，为进一步加深对Sirt6生物学功能的理解，也为研究Sirt6在BMSCs成骨分化中的作用提供新见解。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3～4周龄SD大鼠2只，体质量为250～300 g/只，雌雄不限，由同济大学实验动物中心提供。

1.2 实验试剂及仪器

DMEM培养液（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青公司，中国）；L-抗坏血酸400 μL、β甘油磷酸钠2 mL、地塞米松20 μL、ELISA检测试剂盒（Sigma公司，美国）；TRIzol试剂盒（Invitrogen公司，美国）；Sirt6抗体（1∶2 000）、OCN抗体（1∶2 000）、ALP抗体（1∶1 000）、BSP抗体（1∶2 000）（Abcam公司,英国）；GAPDH（1∶2 000）（CST公司，美国）；山羊抗兔IgG（Beyotime公司，中国）；低温冷冻离心机（卢湘仪离心机仪器有限公司，中国）；酶标仪（BMG LABTECH公司，德国）；Nano Drop2000分光光度计（Thermo公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；RT-qPCR荧光定量仪（ABI公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs体外分离培养与鉴定将SD大鼠处死后，用75%乙醇消毒浸泡，取出其股骨及胫骨，去除周围肌肉组织，随后将其浸泡于适量培养液中。用5 mL注射器吸取一端干垢端，将骨髓中的细胞吸取后冲至培养皿中，反复几次，收集此细胞悬液，用200目滤网过滤去除杂质后，将细胞悬液收集至离心管中，800 r/min离心5 min，弃去上清液，加入适量DMEM培养液混匀后，将其接种于培养瓶中培养，置37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养48～72 h后更换培养液，每3天更换1次培养液。待细胞长满瓶底70%～80%时，用0.25%胰酶消化后，1∶2传代培养，待鉴定后，取P3代细胞用于后续实验[5-6]。

1.3.2 ELISA检测炎性因子TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6的表达用10 μg/mL的LPS刺激BMSCs，参照试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒检测不同时间点（12、24、48、72 h）的对照组及LPS诱导组培养液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，酶标仪波长为450 nm，读取吸光度值，并绘制标准曲线。

1.3.3 过表达Sirt6质粒构建及转染根据实验需求，构建过表达载体，选用质粒pcDNA3.1（+），利用NCBI数据库查找目的基因的mRNA序列，针对蛋白质编码区域（coding sequence，CDS）选用载体设计引物及酶切位点。Sirt6（NM_001031649.1）基因CDS区域全长993 bp，根据载体信息选择酶切位点为上游HindⅢ、下游EcoRⅠ，合成含有酶切位点的目的基因CDS区域序列。引物序列如下，下划线为酶切位点。Sirt6-F：5′-CCCAAGCTTATGTCGGTGAATTATGCAGCAG-3′（HindⅢ）；Sirt6-R：5′-CGGAATTCTCAGCTGGCGGCAGCC-3′（EcoRⅠ）。

根据质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，并进行质粒DNA测序比对。将Sirt6过表达质粒（约1.5 μg）溶于245 μL Opti-mem无血清培养液中，此为A液,而后将5 μL lipo2000溶于245 μL Optimem无血清培养液中，此为B液，混匀后室温下静置5 min。然后将A液与B液混合，室温静置20 min。弃去原培养液，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗1次，再加入2 mL不含血清的培养液。把复合物缓缓加入对应培养液中，摇匀，置37℃培养箱6 h，吸除无血清转染液，放入完全培养液继续培养，转染48 h后进行后续实验。

1.3.4 RT-qPCR检测Sirt6 mRNA的表达实验分为LPS组、LPS+空载体组及LPS+过表达Sirt6组。用TRIzol试剂盒分别从各组细胞中提取总RNA，用cDNA合成试剂盒转化为互补DNA（cDNA）。使用SYBR Green Master Mix的实时检测分析。引物序列如下。Sirt6上游引物：5′-AGGGTTGTCGCCATACGC-3′；下 游 引 物：5′-GGAGGACTGCCACATCAGC-3′。GAPDH上 游 引 物：5′-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3′；下游引物：5′-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3′。反应条件为95℃预变性60 s；95℃30 s，54℃45 s，72℃60 s，共30个循环；72℃延伸10 min。检测Sirt6的扩增效率，实验重复3次取均值。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.3.5 Western blot技术检测BMSCs细胞中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表达用RIPA裂解缓冲液分别提取各组总蛋白。在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中将蛋白质分级，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，放入5%牛血清白蛋白置室温封闭过夜。然后，用一抗和适量的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）偶联的山羊抗兔IgG对膜进行探测。TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min,使用化学发光系统检测蛋白质信号。GAPDH作为内源性参照。逐项分析各组Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表达。

1.3.6 茜素红染色法检测BMSCs矿化情况将各组细胞以1×105个/mL的密度接种于含有成骨诱导培养液的6孔培养板中。该培养液是根据先前研究中的方法制备的，每2天更换1次。诱导21 d后，用4%甲醛固定细胞0.5 h，用茜素红（0.1%，pH 8.3）染色3～5 min。然后，用XDS-600C型显微镜（上海蔡孔光学仪器有限公司，中国）观察各组矿化骨细胞钙结节，放大倍数为200倍。

1.4 数据分析

实验数据采用GraphPad Prism 6软件分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。完全随机设计的两均数比较采用Student-t检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验。结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察

镜下可见聚集的不规则多角形伸长细胞，为BMSCs，继续培养至细胞长满瓶底70%～80%时，贴壁的BMSCs细胞典型，呈梭形、网状，聚集铺开生长。详见图1。

图1 倒置显微镜观察BMSCs的形态特点（×100）Figure 1 Morphological characteristics of BMSCs by reverse microscopy(×100)

2.2 ELISA检 测 炎 性 因 子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达

与对照组相比，同一时间点的LPS诱导组中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均呈现高表达，并且TNF-α的含量明显高于IL-1β、IL-6，差异具有统计学意义（P<0.05）；随着时间的延长，TNF-α的含量未见明显下降，而IL-1β、IL-6的表达量呈现下降趋势。详见图2。

图2 TNF-α、IL-1β、IL-6在不同时间点的表达量对比Figure 2 Expression comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 at different time point

2.3 过表达Sirt6重组真核载体测序结果

通过测序比对，Sirt6无错配、缺失及反向链接。该结果表明过表达Sirt6重组真核载体构建成功，可以用于后续实验。

2.4 RT-qPCR检测Sirt6的mRNA 水平

与LPS组和LPS+空载体组相比较，LPS+过表达Sirt6组中Sirt6的mRNA水平显著升高（P<0.05），差异具有统计学意义（图3）。

图3 RT-qPCR检测不同组Sirt6的mRNA表达水平Figure 3 mRNA expression of Sirt6 in different groups by RTqPCR

2.5 Western blot检测BMSCs中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表达

与LPS组相比较，LPS+空载体组中Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白的表达量未见明显加强（P>0.05），而LPS+过表达Sirt6组中，Sirt6、OCN、ALP、BSP蛋白水平表达量均呈现显著加强（P<0.05）。详见图4。

图4 不同组BMSCs中Sirt6、OCN、ALP、BSP的蛋白表达Figure 4 Protein expression of Sirt6,OCN,ALP and BSP in different groups of BMSCs

2.6 茜素红染色法检测不同组中BMSCs的骨化钙结节生成情况

成骨诱导21 d后，LPS组镜下未见明显的钙结节形成，LPS+空载体组可见极少量的钙结节区域，而LPS+过表达Sirt6组镜下可见大量斑块状的红色钙结节形成，说明过表达Sirt6可以抑制炎症反应，促进骨生成。详见图5。

图5 镜下观察不同组中钙结节的生成量（×200）Figure 5 Microscopic observation of production of calcium nodules in different groups(×200)

3 结论

BMSCs具有较强的免疫抑制特性，能够通过分泌抗炎蛋白，抑制炎性因子的释放和迁移，发挥直接或者间接的抗菌和保护周围组织的作用[7]。此外，研究证实，炎性状态下，BMSCs较牙周膜干细胞具有更强的成骨分化能力[8]。利用LPS诱导BMSCs发生炎症反应，探讨Sirt6在炎性条件下对BMSCs骨向分化的作用，能加深我们对BMSCs成骨的理解。我们通过原代贴壁培养技术从SD大鼠骨髓中成功提取了BMSCs，为后续研究提供了良好的研究载体。

LPS是脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性菌外膜层中特有的一种化学成分，也是内毒素的主要化学成分。LPS具有强大的免疫刺激能力，极低水平的LPS足以能诱导TNF-α和白细胞介素家族（如IL-18）等炎症介质的合成与释放。研究表明，炎性衰老过程中存在大量炎性因子的表达，如IL-1、IL-6和TNF-α等典型炎症标志物水平的升高。衰老与炎症是相互作用的，衰老过程常伴随炎症稳态失衡，而炎症又可导致衰老。牙周炎导致颌骨和牙齿的丧失，即可看作炎性衰老的进程之一。TNF-α促进炎症细胞侵入牙周组织，破坏骨改建的内稳态，使骨代谢发生紊乱，加速骨组织的丧失[9]。本研究利用LPS刺激BMSCs产生炎症反应，检测结果显示，培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量升高，同时BMSCs也具有反向抑制炎症因子分泌的功能。然而，也有学者认为,炎性条件下TNF-α会刺激骨的形成，并推断TNF-α具有不同的功能，可能与TNF-α的干预时间或骨形成的不同阶段有关[10-11]。

已有报道表明，Sirt6可抑制TNF-α诱导的血管外膜成纤维细胞的炎症反应[12]。在骨关节炎（osteoarthritis,OA）软骨和滑液中观察到IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子水平升高，进而增加基质金属蛋白酶的表达，降低软骨胶原和蛋白多糖的含量。Lee等[13]证明，过表达Sirt6可以抑制胶原诱导的关节炎小鼠的炎症反应。此外，Xiao等[14-15]的研究表明，干扰Sirt6可以抑制骨向分化，影响成骨细胞的生成；靶向miR-186下调，可以抑制小鼠BMSCs的成骨分化，而过表达Sirt6则可以逆转这一趋势。本研究中，Sirt6的过表达干扰了炎症BMSCs中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，减弱了炎症反应的程度。这些结果表明，Sirt6在BMSCs中是一种抗炎因子。Sirt6通过抑制促炎细胞因子的分泌，减轻LPS诱导的BMSCs炎症反应。然而，在LPS长时间的作用下，BMSCs也会受到一定的损伤，自身功能会减弱。重要的是，我们发现Sirt6在炎症条件下能刺激BMSCs向成骨细胞分化。过表达Sirt6后，成骨标志物OCN、ALP、BSP的蛋白水平明显升高，并且在LPS的刺激下，骨性分化生成钙结节的表达量明显增多。这一发现与之前的报告[16]一致，Sirt6通过抑制核因子-核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化，也可以通过正向调控骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）通路促进大鼠BMSCs成骨分化。本课题组通过过表达Sirt6调控p38/ERK信号通路，也能促进大鼠BMSCs的成骨分化，但该结果尚未发表。所有这些结果进一步证明，Sirt6在BMSCs的成骨过程中是一个关键的调节因子，具有抑制炎症和促进骨向分化的双重作用。随着年龄的增长，Sirt6蛋白逐渐衰减，炎性衰老趋势明显。因此，如何控制抗衰老蛋白Sirt6的衰减周期，增强Sirt6的表达，进而延长机体的寿命，仍然是摆在我们面前的一个挑战。