刘 飞,池 韵,李锦沂,王盼曦,杨克宇,郭青玉*

(1西安交通大学口腔医院,陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,西安 710004;2西安交通大学口腔医院儿童口腔科;3浙江大学医学院附属邵逸夫医院口腔科;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

牙周膜是位于牙根周围的一种特殊的纤维结缔组织,它维系着牙齿在牙槽骨中的位置,支持其发挥咀嚼功能[1]。牙周膜中未分化的间充质细胞可根据机体需要分化为特定的细胞类型,例如成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞等,在牙周组织的修复中起到了重要作用[2]。关于牙周膜干细胞的研究已成为口腔基础研究中最热门的方向之一[3]。

乳牙和恒牙具有不同的发育进程,两者的形态、组织结构、生命周期也各不相同。当恒牙序列萌出时,乳牙的牙根吸收最终发生脱落,乳牙牙根在外界的刺激下更容易发生吸收[4,5]。有研究发现乳牙牙周膜含有成熟的干细胞,这些细胞的增殖速率、成脂分化能力、成骨分化能力等比恒牙牙周膜组织中的干细胞更强[6]。

乳牙根尖周炎是儿童口腔科的常见疾病,常伴有根分叉、根尖周区域明显的骨质破坏。目前认为,根尖周炎是宿主防御机制与根管腔内细菌相互作用的结果。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)广泛分布于革兰氏阴性菌的细胞壁中,可引起局部发热及白细胞反应[7]。因其致病作用常用于体外炎症模型的建立,例如RAW264.7小鼠巨噬细胞、牙龈上皮成纤维细胞及乳腺上皮细胞等[7-9]。同时,LPS也在牙髓感染、根尖周炎、牙周炎的发生发展中起了重要作用[10]。作为细菌内毒素,其对牙槽骨的吸收、牙周膜的降解都有一定的影响,在诱导体外牙周膜细胞炎性状态中也有大量应用[11]。

本研究采用大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)LPS刺激体外培养人乳牙牙周膜干细胞(human deciduous periodontal ligament cells, hdPDLSCs),通过检测细胞活性及炎症因子表达,选择合适的E.coliLPS浓度,以建立符合实验设计需要的人乳牙根尖周炎细胞模型。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

α-MEM培养基(Hyclone公司,美国),胎牛血清(FBS)(Gibco,美国),CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗体鼠来源单克隆抗体(Abcam,美国),E.coliLPS(Sigma,美国),反转录试剂盒(TAKARA,日本),ELISA试剂盒(IL-1β、IL-6、TNF-α)(联科生物,中国)。实验在西安交通大学口腔医院实验中心完成。

1.2 细胞原代培养及纯化

经医院伦理委员会批准(伦理批号:[2016]045),征得患儿家长的知情同意,采集于西安交通大学口腔医院儿童口腔科因乳牙滞留、外伤或咬合诱导而拔除的乳牙。患者筛选标准:无心脏病等全身系统性疾病,无乙肝、结核等传染性疾病;患牙无龋坏、牙髓炎、根尖周炎等牙体及牙周相关疾病。

拔牙前使用碘伏消毒牙冠及牙龈2-3次,患牙拔除后转移至超净台,取根中1/3的牙周膜,Ⅰ型胶原酶及中性酶37 ℃消化40 min,加入含20%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化。原代细胞长出后进行首次换液,之后2-3 d换液一次。当细胞增殖至培养瓶底壁约70%时进行传代。取第3代细胞采用连续梯度稀释法进行纯化。

1.3 细胞表面标记物检测

取第4代对数期细胞制备细胞悬液加入1.5 ml EP管(1×106个细胞/管),分别加入直接荧光标记的小鼠抗人CD146、STRO-1、CD105、CD90、CD29、CD45、CD34抗体20 μl。避光4 ℃孵育30 min,加入300 μl无菌PBS重悬,流式细胞仪上机检测细胞表面分子表达水平。

1.4 细胞多向分化能力检测

将第4代对数期细胞采用成骨诱导液(含10%胎牛血清的α-MEM培养基、地塞米松10 mol/L、L-抗坏血酸50 μg/ml、β-甘油磷酸钠10 mmol/L)培养28 d后,进行茜素红染色;采用成脂诱导液(含10%胎牛血清的α-MEM培养基、地塞米松0.25 μmol/L、吲哚美辛10 μmol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、L-抗坏血酸2-磷酸盐100 μmol/L)培养28 d后,进行油红O染色。

1.5 CCK-8检测E. coli LPS处理后hdPDLSCs增殖活性

取第4代hdPDLSCs以2 000/孔的浓度接种96孔板,24 h后替换含不同终浓度的E.coliLPS(0,0.1,0.075,0.05,0.025,0.01 μg/ml)培养基,其中0 μg/ml为对照组。分别培养24,48,72 h后以1 ∶10的CCK-8溶液替换原液。37 ℃孵育2 h后酶标仪检测450 nm波长处吸光度(optical density, OD值)。空白对照组为不含LPS的同种培养基,每组设5个复孔,绘制细胞生长曲线图。

1.6 实时定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的细胞浓度接种于6孔板24 h替换为含不同终浓度的E.coliLPS培养基各2 ml,其中对照组为0 μg/ml,实验组为0.1,0.05,0.01 μg/mlE.coliLPS组,每组设3个复孔,24 h后提取RNA,进行RT-PCR检测。RT-PCR逆转录体系包括:5×PrimerScript RT Master Mix 2 μl,mRNA(10 μl体系最多使用500 ng mRNA)以及RNase Free H2O(补足至10 μl体系)。RT-PCR上机反应液体系包括:SYBR Premix Taq Ⅱ 10 μl,前引物10 μmol/L 0.8 μl,后引物10 μmol/L 0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl,cDNA溶液2 μl,无菌蒸馏水6 μl,总计20 μl。炎症因子引物序列见表1。

表1 炎症因子引物序列Table 1 Sequence of inflammatory factors

1.7 ELISA检测炎性因子蛋白表达

取第4代hdPDLSCs以2×105/ml的细胞浓度接种于6孔板24 h替换终浓度含0.05 μg/mlE.coliLPS的培养基,对照组为0 μg/ml,每组设3个复孔。24 h后离心取上清进行IL-1β、IL-6、TNF-α的ELISA检测。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 细胞原代及传代培养

原代培养7 d后,倒置显微镜下可见组织块周围长梭形细胞爬出,10 d后呈放射状贴壁生长。细胞形态多为长梭形,偶可见多角形。3周后组织块周围细胞密集排列,覆盖瓶底约70%。此时进行细胞传代培养,传代后细胞3-5 d可长至瓶底约70%,细胞形态呈长梭形(见图1)。

A.离体乳牙 B.原代培养中hdPDLCs自组织块游离图1 hdPDLCs的分离培养Figure 1 Primary culture of hdPDLCs

2.2 连续梯度稀释法纯化细胞

连续梯度稀释培养法纯化细胞,倒置相差显微镜下挑选96孔板内单个细胞的孔,培养2周后细胞生长覆盖孔底70%时进行传代培养,依次接种于24孔板、6孔板扩大培养,得到纯化的hdPDLSCs(见图2)。

A.稀释得到单个细胞 B.筛选出的单细胞形成克隆图2 连续梯度稀释法培养hdPDLSCsFigure 2 Culture of hdPDLSCs by serial dilution culture method

2.3 hdPDLSCs的鉴定

流式细胞仪检测细胞表面标记物,显示hdPDLSCs高表达间充质干细胞早期标志物CD146(67.05%)和STRO-1(99.85%),高表达间充质干细胞表面标志物CD105(99.94%)、CD90(100%)和CD29(100%),低表达血管内皮细胞表面标志物CD45(1.72%)和CD34(0.31%,见图3)。实验结果表明,培养的hdPDLSCs符合间充质干细胞表面标记的表达。

图3 hdPDLSCs表面标志物检测Figure 3 Identification of cell surface markers of hdPDLSCs

成骨诱导28 d,茜素红染色后发现,hdPDLSCs诱导后形成密度、大小不一的红色矿化结节,矿化结节呈同心圆状(见图4A,B)。成脂诱导28 d,油红O染色后发现,hdPDLSCs诱导后形成油红O阳性的串珠状脂肪小滴,脂滴聚集呈簇状(见图4C)。

A.成骨分化 B.矿化结节 C.成脂分化图4 hdPDLSCs多向分化能力检测Figure 4 Multidirectional differentiation ability test of hdPDLSCs

2.4 不同浓度E. coli LPS处理后的细胞增殖活性的变化

0-72 h内6组细胞的OD值随时间的延长均显著增高(P<0.05)。0.1,0.075 μg/ml LPS分别刺激24,48,72 h时,OD值较对照组显著降低(P<0.05);0.05,0.025,0.01 μg/ml LPS分别刺激24,48,72 h时,OD值与对照组相比未见明显差异。因此可认为当LPS浓度0.075-<0.1 μg/ml时,对hdPDLSCs增殖活性有显著的抑制作用;当LPS浓度小于0.05 μg/ml时,对细胞的增殖活性无明显影响(见图5)。E.coliLPS作用24 h即可引起OD值的显著变化,且LPS刺激0-72 h可维持OD值相同的变化趋势;当LPS的浓度小于等于0.05 μg/ml时,细胞的增殖不受影响(见图5)。因此选择0.05 μg/ml的LPS刺激hdPDLCs 24 h进行后续的实验。

同浓度与24 h组相比,*P<0.05;同时间与0 μg/ml相比,#P<0.05图5 CCK-8检测hdPDLSCs在不同浓度的E. coli LPS刺激下的增殖活性Figure 5 Proliferation of hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5 不同浓度E. coli LPS处理后的细胞炎症因子表达的变化

2.5.1E.coliLPS刺激下炎性因子mRNA水平表达的改变 real-time PCR结果显示,0.01,0.025,0.05 μg/ml组IL-1β的mRNA表达的水平均显著高于0 μg/ml组(P<0.05),且0.05 μg/ml组IL-1β的mRNA表达水平显著高于0.01 μg/ml组和0.025 μg/ml组(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml组IL-6的mRNA表达的水平均显著高于0 μg/ml组(P<0.05),且0.05 μg/ml组IL-6的mRNA表达水平显著高于0.01 μg/ml组(P<0.05)。0.01,0.025,0.05 μg/ml组TNF-α的mRNA表达的水平均显著高于0 μg/ml组(P<0.05),且0.05 μg/ml组及0.025 μg/ml组TNF-α的mRNA表达水平显著高于0.01 μg/ml组(P<0.05,见图6)。即随着LPS浓度的升高,炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达逐渐升高。

与0 μg/ml组相比,*P<0.05;与0.01 μg/ml组相比,#P<0.05;与0.025 μg/ml组相比,&P<0.05图6 hdPDLSCs在不同浓度E. coli LPS刺激下IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的变化Figure 6 The mRNA levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by different concentrations of E. coli LPS

2.5.2E.coliLPS刺激下炎性因子蛋白水平表达的改变 ELISA结果显示,对照组细胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量较低。与对照组相比较,0.05 μg/ml的E.coliLPS刺激hdPDLSCs 24 h后,细胞上清中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.05,见图7)。

与对照组相比,*P<0.05图7 hdPDLSCs在E. coli LPS刺激下炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白分泌变化Figure 7 Protein levels of IL-1β, IL-6,TNF-α in hdPDLSCs stimulated by E. coli LPS

3 讨论

进行牙周膜细胞的体外培养时,牙周膜细胞的分离培养一直是限制研究进行的重要步骤之一。传统的牙周膜细胞原代培养方法分为酶解法和组织块消化法两种常规方法。有学者[12]结合两种原代培养方式的优点,总结出酶解组织块法,Ⅰ型胶原酶处理组织块后,将组织块固定于壁底,4 h后翻转培养瓶使培养基浸润组织块,可以取得更好的原代培养成功率。本实验发现采用酶解法结合组织块法可提高hdPDLCs原代培养的成功率。为了分离得到乳牙的牙周膜干细胞,需要对培养得到的原代细胞进行单克隆筛选。此法在一块96孔板中完成细胞的梯度稀释,节约了细胞用量,可以得到分离的单细胞进行后续培养。

牙周膜组织中含有多种细胞成分,需进行干细胞的表型鉴定及多向分化能力进行验证[13]。但目前尚无公认的鉴定标志物进行牙周膜干细胞的生物学特征鉴定。在不同研究中,采用的鉴定指标各不相同[13,14]。有的研究采用单一指标进行检验,也有采用多项指标进行综合鉴定。常用的阳性标志物包括:CD146、CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、STRO-1等,常用的阴性指标包括CD45、CD34等[14]。本实验综合多位学者的研究,对间充质干细胞早期标志物CD146、STRO-1,间充质干细胞表面标志物CD105、CD90、CD29,血管内皮细胞表面标志物CD45、CD34进行检测。流式细胞术检测结果表明培养的hdPDLSCs是间充质细胞来源,经诱导后具有多向分化的潜能,可用于后续的试验研究。

以往学者进行牙周膜干细胞的炎症诱导时,使用的LPS浓度各不相同。Andrukhov等[15]在研究E.coliLPS对人恒牙牙周膜干细胞炎症效应的影响时,选择1 μg/ml的浓度来刺激细胞;Jönsson等[16]在研究LPS对牙周膜干细胞IL-8及MCP-1表达水平的影响时,选择0.5 μg/ml的浓度为工作浓度;Kukolj等[17]则选择了E.coliLPS 0.1-10 μg/ml作为炎症诱导工作浓度;Li等[18]使用0.1 μg/ml的E.coliLPS诱导牙周膜干细进行研究;杨芳等[19]在研究LPS对人牙周膜干细胞的炎症及骨稳态效应影响的实验中,比较了不同浓度LPS对人牙周膜干细胞IL-1β表达的促进作用,最终选择了1 μg/ml作为其刺激浓度;还有学者使用10 μg/ml作为炎症诱导的工作浓度。可见对于LPS诱导牙周膜干细胞炎症状态时,LPS的工作浓度仍存在争议。结合前人的研究,LPS的浓度选择需要考虑两方面的内容:LPS的刺激对细胞的活性没有明显的抑制作用,并且细胞能表现出炎症的状态。上述研究结果均以人恒牙牙周膜干细胞作为研究对象,尚无对炎症hdPDLSCs的探索。因此本实验设置了0-0.1 μg/ml的LPS浓度梯度,发现在0.01-0.05 μg/ml的浓度范围内,LPS对于细胞活性没有明显的影响,而超过0.075 μg/ml后,LPS对细胞增殖活性存在明显的抑制作用(P<0.05)。

乳牙生理性牙根吸收的过程中,炎症相关因子IL-1、IL-6和TNF-α的表达增多。hdPDLSCs通过调节炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的表达以及调节成骨、破骨相关因子的表达,进而促进了破骨细胞的活化成熟以致乳牙发生生理性根吸收。IL-1、IL-6和TNF-α还可以作用于破骨细胞及其前体细胞直接发挥作用。本实验发现在0.05 μg/ml的浓度下,不仅IL-1β、TNF-α这两种关键炎性因子的表达受到明显促进,其他炎症相关因子如IL-6的表达也有明显地提高(P<0.05)。因此0.05 μg/ml的E.coliLPS可作为诱导hdPDLSCs炎症模型的适宜浓度。