匡 婷，康佳文 ，郭思慧，李乐赛，张 勇

（1.湖南省肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，长沙 410013；2.湖南师范大学医学院，长沙 410013）

根据2018年全球癌症统计，宫颈癌是女性生殖道排名第一的恶性肿瘤［1］，淋巴结转移阳性的患者预后差［2-4］。外泌体是细胞主动分泌的囊泡样小体，能自由经过淋巴管运输通道，可通过携带调节肿瘤转移的miRNAs，促进肿瘤淋巴结转移［5，6］。在本研究中，我们对宫颈癌淋巴结组织标本进行miRNAs的筛选及验证，探索外泌体携带的miRNA-217影响宫颈癌淋巴转移的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本收集与检测患者签署知情同意书，根据术后病理结果选取淋巴结组织标本，淋巴结阳性（LN+）患者3例，淋巴结阴性（LN-）患者3例。RTqPCR 检测淋巴结组织中miR-217，miR-9-5p和miR-338-3p含量。

1.2 RT-qPCR 检测miRNA 表达Trizol法提取淋巴结组织总RNA，反转录为cDNA，实时荧光定量PCR两步法试剂盒进行检测。反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，50 s，40个循环。以GAPDH作为参照，测定miR-217、miR-9-5p 和miR-338-3p基因水平，采用2-ΔΔCt法检测各样品基因的相对表达水平。引物交由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 细胞培养、转染及分组Siha细胞为本室保存，人淋巴内皮细胞（HLEC）购自德国海德尔堡PromoCell公司。细胞复苏后用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI1640培养。用lenti-mCherry/miR-217转染Siha细胞。细胞实验分组为：空白组（Siha 细胞）、阴性对照组（Siha 细胞慢病毒空载组，LV-NC）、阳性实验组（Siha细胞慢病毒miR-217 沉默组，LV-miR-217-siRNA）。收集各组细胞外泌体进行后续实验。

1.4 细胞外泌体的提取及鉴定依据试剂盒（ExoQuick-TC）说明书提取宫颈癌Siha细胞分泌的外泌体，电镜观察形态，加蛋白裂解液提取蛋白，使用Hsc70，CD63 和CD81 抗体，进行流式细胞学蛋白检测鉴定外泌体。……