孙宇轩 唐晓敏 徐晨宇 郭小涛 赵轶 梁越 潘春晨 孙家强 孙敬武

氯化锂(lithium chloride, LiCl)在临床上常用于治疗双向情感障碍[1]。氯化锂治疗剂量和中毒剂量的安全范围小，具有明显的神经毒性、肾毒性和生殖毒性[2,3]。在人体内，严重的氯化锂中毒可引起明显的不可逆性听力损失[4]。近期有研究表明，氯化锂可以激活脑组织中c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表达并促进细胞凋亡[5,6]。但有关氯化锂对内耳影响的研究目前甚少，尚不清楚氯化锂是否能通过JNK信号通路对耳蜗毛细胞造成损伤，从而造成听力损失。故本研究拟通过建立体外HEI-OC1毛细胞样细胞的氯化锂损伤模型，探讨氯化锂对HEI-OC1毛细胞样细胞的作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养 HEI-OC1(House Ear Institute-organ of Corti 1)小鼠耳蜗毛细胞样细胞株由美国House耳科研究所提供。将细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖液体培养基(Gibco，美国)中，在33℃、含10% CO2空气的条件下采用TC处理后的六孔培养板培养，每孔细胞1×106个/mL，每2～3天换液，当细胞密度接近80%时传代。

1.2CCK-8检测氯化锂对HEI-OC1毛细胞样细胞的抑制并计算IC50值 采用CCK-8试剂盒(生工公司，中国)对细胞进行检测。HEI-OC1毛细胞样细胞制成细胞悬液，以5×104个/mL的细胞浓度接种于96孔板中，每孔含100 μL完全培养基。在33℃、含10%CO2的空气条件下培养过夜后，分组加入氯化锂，浓度分别为0、25、50、75、100、125、150 mM；继续在33℃、含10%CO2空气的条件下培养。分别在12、24、48、72小时分别加入10 μL的CCK-8试剂，孵育2小时后采用酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)设定在450 nm处检测每孔的吸光度值，每个样本至少有三个重复，根据吸光度值绘制各组细胞的抑制曲线，根据拟合曲线计算出氯化锂24小时的IC50值。

1.3氯化锂诱导小鼠HEI-OC1毛细胞样细胞毒性模型制备及实验分组 取经上述培养后处于对数生长期的HEI-OC1毛细胞样细胞分为对照组、实验组、DMSO组、JNK抑制组。对照组不进行任何干预，仅在含10%胎牛血清的DMEM高糖液体培养基中培养24小时；实验组加入含有IC50浓度氯化锂(Sigma，美国，8M)和10%胎牛血清DMEM高糖液体培养基干预24小时；DMSO组(溶剂组)和JNK抑制组分别加入0.1%(v/v)DMSO(生工公司，中国)和20 μM SP600125(碧云天，中国)预处理2小时后，再加入含有IC50浓度氯化锂(Sigma，美国，8M)的含10%胎牛血清DMEM高糖液体培养基干预24小时；这两组仅进行Western blot实验以验证氯化锂是否通过JNK信号道路诱导细胞凋亡。

1.4TUNEL法检测细胞凋亡 将各组HEI-OC1毛细胞样细胞培养于爬片上，用4%多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗两次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟，PBS清洗两次，加入TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟，DAPI复染样品5分钟，倒置荧光显微镜成像(徕卡，德国)。对每个视野下TUNEL阳性细胞进行计数，统计得出各组细胞凋亡率。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 取经上述分组干预后的HEI-OC1毛细胞样细胞，通过使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD，美国)检测细胞凋亡率。在室温下，在含有饱和浓度的Annexin V-FITC和碘化丙锭(PI)的结合缓冲液中染色细胞15分钟，使Annexin V-FITC的特异性结合发生。通过流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)分析细胞凋亡率，细胞计数10 000个。

1.6反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX、Bcl-2 mRNA表达 取经上述分组干预后的HEI-OC1毛细胞样细胞用RNAiso Plus(Takara bio，日本)从预处理的HEI-OC1毛细胞样细胞中提取总RNA，用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒(Takara bio，日本)反转录为cDNA，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(Takara bio，日本)进行扩增。本实验所用引物均由生工生物公司合成，各基因的引物见表1。

表1 RT-PCR使用的引物序列

1.7免疫印迹实验(Western blot)检测细胞Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、JNK、p-JNK、BAX、Bcl-2蛋白表达 取经上述分组干预后的HEI-OC1毛细胞样细胞，消化收集并加入RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，4℃ 12 000 rpm离心15分钟，取上清液用BCA试剂盒(碧云天，中国)测定蛋白质浓度。稀释到合适浓度后，依次进行电泳、转膜、封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1小时。使用ECL发光液(碧云天，中国)曝光，以GAPDH(1∶1000，CST，美国)为内参，分别测算Cleaved-Caspase-3(1∶1000，CST,美国)、Cleaved-Caspase-9(1∶1000，CST,美国)、JNK(1∶2000，CST，美国)、p-JNK(1∶2000，CST，美国)、BAX(1∶1000，CST，美国)、Bcl-2(1∶1000，CST，美国)的灰度值，并计算相对表达水平。

1.8统计学方法 所有数据利用SPSS 19.0统计软件进行分析，所有数据均来自每组三个以上的重复样本，采用均数±标准差进行统计描述，采用t检验和单向方差分析进行统计学分析。

2 结果

2.1CCK-8检测细胞抑制结果 氯化锂对HEI-OC1毛细胞样细胞抑制作用见图1，抑制率与药物作用时间、浓度呈正相关(P<0.01)。拟合出氯化锂在24小时的IC50值为69.53 mM，故实验组采用的氯化锂浓度约为24小时IC50值70 mM。

图1 CCK-8检测不同浓度和作用时间氯化锂对HEI-OC1毛细胞样细胞的抑制率

2.2TUNEL检测细胞凋亡结果 对照组和实验组经过不同干预处理后的HEI-OC1毛细胞样细胞的TUNEL荧光染色如图2，并对TUNEL阳性细胞进行计数，结果显示实验组凋亡率(36.00%±2.65%)明显高于对照组(2.33%±0.58%),差异均有统计学意义(t=21.53,P<0.01)。

图2 免疫荧光染色显示HEI-OC1毛细胞样细胞中TUNEL的表达(×200) 蓝色荧光为DAPI，红色荧光为TUNEL

2.3流式细胞术检测细胞凋亡结果 如图3所示，与对照组(0.42%±0.02%)相比，实验组的HEI-OC1毛细胞样细胞的早期凋亡率明显增加至42.40%±0.82%。差异具有统计学意义(t=88.33,P<0.01)。

图3 流式细胞术检测HEI-OC1毛细胞样细胞凋亡

2.4RT-PCR结果 由表2可见，与对照组相比，实验组Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX mRNA表达增加，Bcl-2 mRNA表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 RT-PCR检测对照组和实验组Caspase-3、Caspase-9、JNK、BAX、Bcl-2 mRNA相对表达量

2.5Western blot结果 由表3、图4可见，与对照组相比，实验组Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX蛋白表达增加，Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01);与实验组相比，DMSO组各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与实验组相比，JNK抑制组Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX蛋白表达减少，Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图4 Western blot检测各组HEI-OC1毛细胞样细胞中Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、JNK、P-JNK、BAX、Bcl-2、GAPDH蛋白条带

表3 Western blot检测各组Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、p-JNK、BAX、Bcl-2、Bcl-2/BAX蛋白相对表达量

3 讨论

氯化锂作为一种治疗剂量和中毒剂量的安全范围较小的临床一线药物，在血清中的浓度高时，对多器官的潜在毒性作用一直是临床使用氯化锂的一大障碍[7]。有研究(Donaldson,1981)称氯化锂中毒可以引起听力损失，然而目前尚不清楚氯化锂通过何种方式造成了听力损失。为了探究这一问题，本研究首先建立了HEI-OC1毛细胞样细胞的氯化锂损伤模型，并发现氯化锂对细胞的抑制率与作用时间、浓度呈正相关，与文献(侯永根，2003)报道一致。近期有研究表明，氯化锂可以促进细胞凋亡[6,8]，本研究中，TUNEL细胞凋亡检测及流式细胞术结果均显示，实验组细胞凋亡率显著高于对照组，说明氯化锂确实可以引起HEI-OC1毛细胞样细胞凋亡率增高。有研究表明，氯化锂可以激活脑组织中JNK的表达[5]，提示氯化锂可能通过JNK通路诱导了细胞凋亡。JNK是一种属于哺乳动物丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的丝氨酸/苏氨酸激酶[9]，JNK在死亡受体启动的外源性和线粒体内源性凋亡通路中发挥重要作用[10]；JNK通过直接磷酸化可以抑制Bcl-2的表达，并促进Bad和Bax的活化，活化的Bax和Bad诱导线粒体外膜的通透性，从而使细胞色素C从线粒体膜间隙释放，释放的细胞色素C与Apaf-1和Caspase-9结合形成凋亡小体，继而触发Caspase-9级联反应，激活Caspase-3和Caspase-7，引起细胞凋亡[11]。在本研究中，RT-PCR和Western blot实验结果均说明氯化锂增加了p-JNK、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、BAX的表达，减少了Bcl-2、Bcl-2/BAX的表达，表明氯化锂可能通过JNK通路诱导了细胞凋亡的发生。为了进一步验证氯化锂是否通过JNK信号通路诱导凋亡，本研究使用JNK抑制剂SP600125对细胞进行预处理，Western blot实验结果显示，JNK抑制组JNK的磷酸化受到抑制，p-JNK、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、BAX表达较实验组减少，Bcl-2、Bcl-2/BAX表达增加，进一步证明了氯化锂通过JNK信号通路诱导了HEI-OC1细胞的凋亡。

综上所述，氯化锂可以诱导HEI-OC1毛细胞样细胞的凋亡，其机制可能为通过JNK通路相关的线粒体凋亡途径，并对Caspase-3、Bcl-2也具有调控作用。然而，本研究具有一定局限性，仅使用HEI-OC1毛细胞样细胞建立体外氯化锂损伤模型，但氯化锂在动物体内的剂量浓度、代谢效率与体外存在差距，故氯化锂损伤毛细胞的具体机制还有待于进一步的研究。