刘东亮 马秀岚

中耳胆脂瘤的病理特征是异常强大的增殖和失调的凋亡。目前在增殖方面已经基本达成共识，但在凋亡方面的观点尚未达成一致，有学者认为胆脂瘤中促进凋亡因素起了主要作用，而另一些研究却发现抗凋亡也发挥了作用(kojima,1998)。DAPI广泛用于细胞的凋亡指数检测和评定[1,2]，其通过蓝色荧光强度反映核凋亡的情况和周期，正常细胞核染色后呈弱蓝色，而凋亡小体可见近于白色的强光。故本研究利用DAPI核染色判定胆脂瘤细胞中的凋亡情况。

人类叉头框O3(forkhead box O3,FOXO3)是叉头框转录因子家族(forkheadbox，FOX)的O亚族一员，参与调节细胞周期、促进凋亡、抗氧化应激在内的多种生物学行为调控[3,4]，其广泛表达于成人的各种组织器官中。FOXO3发挥其功能的方式主要是通过对其靶基因转录水平的调节来完成的[5]。唯BH3域蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)作为仅含有一个BH3结构域的Bcl-2蛋白，通过与Bcl-2家族其他成员相互作用，形成同源或异源二聚体发挥抗凋亡或促凋亡作用[6]。本研究拟通过免疫组化、免疫荧光及Western blot方法检测中耳胆脂瘤组织和正常皮肤中FOXO3、Bim及DAPI的表达情况，并分析它们之间的相关性，探讨其在中耳胆脂瘤形成过程中对细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1中耳胆脂瘤及正常皮肤标本采集 选取2019年7～12月在中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科确诊并行手术的中耳胆脂瘤标本30例，其中，男18例，女12例；年龄16～80岁，平均55.57±18.67岁；左耳14例，右耳16例；病程2～30年，平均17.63±12.33年；术后均经病理诊断为中耳胆脂瘤。同时回收耳甲腔成形术中废弃及不能使用的耳后正常皮肤或皮肤碎块15例作为对照组(术前已告知患者同意并签署知情同意书)，其中男9例，女6例；年龄30～55岁，平均46.73±10.67岁；左耳7例，右8例；病程5～25年，平均14.56±9.83年。

1.2研究方法

1.2.1免疫组化染色检测FOXO3、Bim表达和定位 从液氮桶取出标本立即甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，每个标本切片3张。按照SABC试剂盒说明书操作。已知阳性切片作阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。主要步骤：将石蜡切片放入60 ℃烤箱1小时，二甲苯脱蜡三次，每次10分钟。梯度酒精水化，蒸馏水冲洗，PBS液浸泡10分钟。3%过氧化氢去离子水室温孵育10分钟，PBS冲洗4次×2分钟。采取胃蛋白酶行酶修复抗原修复20分钟，之后PBS冲洗3次×3分钟。滴加试剂A(封闭用山羊血清工作液)室温孵育15分钟，倾去勿洗。滴加适当比例的一抗，4 ℃冰箱过夜。次日取出后PBS冲洗3次,每次3分钟，滴加试剂B(二抗)，37 ℃孵育15分钟，PBS冲洗3次,每次3分钟。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15分钟，PBS冲洗3次×3分钟。滴加立即配制的DAB显色液，在显微镜下控制背景，显色约3.5分钟左右用水充分冲洗，苏木素复染半分钟，蒸馏水冲洗，自来水返蓝30分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察显色情况并在100、200及400倍下照相，400倍显微镜下随机取5个不重叠视野进行阳性细胞计数，计算阳性细胞占比率。结果判定：在出现棕黄色颗粒的阳性细胞标准基础上，综合染色强度及阳性细胞数2个方面进行分析：①染色强度计分：没有染色0分，微弱棕黄色1分，中等强度棕黄色2分，深棕色3分；②阳性细胞计数：每个视野计数200个细胞，计算5个视野的阳性细胞的占比率：没有细胞着色0分，<20%细胞着色1分，21%～50%细胞着色2分，>50%细胞着色3分；③染色强度计分和阳性细胞占比计分相乘结果作为该样本最终结果，得分为0～2分为阴性样本(—)，≥3分者为阳性样本(+)。每一个标本都由不同的三名技术人员计数，综合统计三个报告得出结果。

1.2.2免疫荧光染色检测Bim、DAPI的表达和定位 将上述切片取出，在切片上直接滴加少量DAPI染液，覆盖住标本即可，避光室温孵育10 min。玻片置于脱色摇床上的PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察保存图像(DAPI紫外激发波长330～380 nm，发射波长420 nm，发蓝光)并用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件进行半定量分析。结果判读：Bim阳性表达为绿光。DAPI染色的细胞核在紫光的激发下为蓝色，正常细胞中仅有部分染色质出现轻度浓缩，荧光显微镜下可见弱蓝光，凋亡亢进的细胞核出现凋亡小体，可见白蓝色强光，凋亡低下的细胞核染色呈深蓝色。

1.2.3Western blot免疫印迹法检测FOXO3和Bim蛋白的表达 组织块用PBS洗涤3次，剪成小块置于匀浆器中。彻底匀浆后转移至1.5 ml离心管中冰浴30 min，期间反复吹打，确保细胞完全裂解。12 000 rpm离心10 min，收集上清。干净玻璃板灌胶与上样，玻璃板放入卡夹，对齐挤紧以免漏胶。配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。45 min后倒去胶上封水并用吸水纸将残留水吸干。配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，待剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶。加足够的电泳液。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75 V，分离胶用120 V。待电泳刚跑出至溴酚蓝即可终止电泳。准备6张8 cm×9 cm的滤纸和一张大小适中的预先甲醇活化PVDF膜。将转模夹子打开使黑的一面保持水平，在垫子上垫海绵及三层滤纸，小心剥下分离胶盖在滤纸上，将膜盖于胶上，在膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫。25 V恒压转膜过夜。次日将转好的膜于室温下5%的脱脂牛奶封闭1 h。稀释一抗4 ℃孵育抗体3小时。用TBST在室温下脱色摇床上洗3次×5 min。加稀释二抗室温下孵30 min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次×5 min。将PVDF膜的蛋白面朝上与ECLA和ECLB混合液充分接触，1～2 min后，去尽残液，放入暗匣中曝光。根据不同的光强度调整曝光条件。将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.3统计学方法 应用 SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料两两比较用卡方检验，计量资料比较用两样本t检验，运用Pearson检验进行两两的相关性分析。

2 结果

2.1免疫组化染色结果(图1) FOXO3在中耳胆脂瘤和正常皮肤中的细胞核及胞质均有着色。30例胆脂瘤样本中细胞核FOXO3阳性11例(36.7%，11/30)，15例正常皮肤中细胞核FOXO3阳性样本13例(86.7%，13/15)，前者阳性率低于后者，差异有统计学意义(χ2=10.04，P<0.05)；30例胆脂瘤样本细胞质中FOXO3阳性样本10例(30.0%，10/30)，正常皮肤细胞质中FOXO3阳性样本12例(80.0%，12/15)，前者阳性率低于后者，差异有统计学意义(χ2=8.72，P<0.05)。Bim着色于胆脂瘤和正常皮肤的细胞质，30例胆脂瘤标本中有16例阳性(53.3%，16/30)，明显低于正常皮肤组织的93.3%(14/15)，差异有统计学意义(χ2=7.20，P<0.05)。

图1 FOXO3和Bim免疫组化染色结果(SABC法×200) a.胆脂瘤中FOXO3染色情况，FOXO3在细胞核及胞质均有着色，其中细胞核FOXO3阳性率为36.7%，细胞质FOXO3阳性率为30.0%；b.正常皮肤中FOXO3染色情况，FOXO3着色在细胞核及胞质，细胞核FOXO3阳性率为86.7%，细胞质FOXO3阳性率为80%；c.胆脂瘤中Bim染色情况，着色于细胞质，阳性率为53.3%；d.正常皮肤中Bim染色情况，细胞质染色，阳性率为93.3%

2.2免疫荧光染色结果(图2) 荧光显微镜下，Bim显色在细胞质，胆脂瘤中为暗绿色，在正常皮肤呈亮绿色；DAPI染色于细胞核，胆脂瘤中为深蓝色，在正常皮肤呈亮蓝色；用Image-Pro Plus 6.0 图像软件分析荧光值发现Bim在中耳胆脂瘤的荧光值(35.16±4.21)明显弱于正常皮肤(82.51±7.34)，差异有统计学意义(t=1.71,P<0.05)；DAPI在中耳胆脂瘤的荧光值(25.37±3.67)弱于正常皮肤(91.45±10.14)，差异有统计学意义(t=1.93,P<0.05)。

图2 Bim与DAPI免疫荧光染色图 a.Bim在胆脂瘤标本染色情况，荧光为暗绿色，着色于细胞质；b.DAPI在胆脂瘤的染色情况，染色于细胞核，荧光深蓝色；d.Bim在正常皮肤染色情况,荧光为亮绿色；e.DAPI在正常皮肤的染色，亮蓝色，染色于细胞核；c.a、b的融合图；f为d、e的融合图

2.3Western blot检测结果(图3) FOXO3在胆脂瘤的相对灰度值为0.43±0.04，明显低于正常皮肤(0.94±0.11)，差异有统计学意义(t=2.01,P<0.05)；Bim在胆脂瘤的相对灰度值(0.59±0.05)也低于正常皮肤(1.05±0.09)，差异有统计学意义(t=1.99,P<0.05)。

图3 FOXO3和Bim在胆脂瘤和正常皮肤的表达

2.4Bim和DAPI的相关性分析 Pearson相关性分析显示，Bim和DAPI在中耳胆脂瘤中表达呈显著正相关(r=0.501,P<0.01)，FOXO3和Bim的表达呈正相关(r=0.362,P<0.05)。

3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的有序死亡，是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达和调控等。关于胆脂瘤的凋亡，目前存在两种观点，即凋亡加强和凋亡受抑制，表现在信号传导因子的作用即促凋亡和抗凋亡。

赞成中耳胆脂瘤凋亡加强的学者认为，胆脂瘤之所以不是恶性肿瘤就在于不仅增殖异常，同时凋亡也增强，这样维持胆脂瘤不会恶性生长。Park等[7]发现中耳胆脂瘤中肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导剂(TWEAK)通过调节肿瘤坏死因子(TNF)表达起到促细胞凋亡的作用。Zhang等[8]证明微小RNA let-7a通过下调微小RNA21促进G0/G1期细胞周期停滞来诱导胆脂瘤细胞凋亡。而另一些研究却发现抑制凋亡的信号因子在中耳胆脂瘤中出现或者提高了，如：Kim等[9]比较中耳胆脂瘤和耳后皮肤中甘菊酯gankyrin蛋白、抑癌基因p53蛋白和核蛋白Ki-67表达，结果发现gankyrin表达上调抑制了凋亡；Szczepanski等[10]研究高迁移率族蛋白HMGB1对人永生化角质形成细胞(HaCaTs)增殖、迁移和凋亡的影响，发现HMGB1阻止HaCaT细胞凋亡，促进其形成胆脂瘤细胞。

本研究通过DAPI染色，发现中耳胆脂瘤细胞总体呈现凋亡被抑制的状态，表现为胆脂瘤中DAPI呈深蓝色，荧光值明显弱于正常皮肤，所以认为胆脂瘤总体表现为抑制凋亡的情况；且胆脂瘤中DAPI的减弱程度与Bim呈显著的正相关，所以考虑胆脂瘤的凋亡受抑制与Bim通路相关。

FOXO3主要作用为抑制细胞生长、促凋亡、抗氧化应激等[3,4]。FOXO3蛋白活性主要受亚细胞的定位影响[11]，作为转录因子，在细胞核的FOXO3才能发挥作用。而蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)可磷酸化FOXO3，磷酸化的FOXO3与DNA亲和力下降，同时与蛋白14-3-3结合，移出胞核转到胞质被泛素化降解，从而失去转录作用[12]。文中结果显示，胆脂瘤中细胞核、细胞质FOXO3的表达均低于正常皮肤。核FOXO3主要负责凋亡的调控，研究发现下游的Bim[13]与其关系最为密切。

Bim属于B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族中的一个亚族，即仅含有一个BH结构域且促凋亡的BH-3亚族[14]，被称为“唯BH3域蛋白”，在多种疾病中都表现异常，如乳腺癌[15]、前列腺癌[16]以及非小细胞肺癌细胞[17]等，是近年来研究较多的促凋亡蛋白。Bim主要在胞质，确切的说在线粒体周围，通过同源结构域直接或间接的方式激活同属Bcl-2家族的Bax(Bcl-2-associated X proten)蛋白和Bak(Bcl-2 homologous antago-nist/killer)蛋白。激活的Bax/Bak插入线粒体外膜，引起膜通透性改变，释放细胞色素C(cyt C)，后者通过和接头蛋白Apaf1发生寡聚化而与半胱天冬氨酸蛋白酶9(caspases-9)形成凋亡小体，引发caspase级联反应导致细胞凋亡[18]。本研究显示，Bim在胆脂瘤中的表达明显低于正常皮肤，且与FOXO3的低表达呈正相关，同时也与DAPI的减弱呈正相关。再结合之前的研究[19]发现胆脂瘤中磷酸化的AKT(P-AKT)表达增加，所以推测，在中耳胆脂瘤的形成过程中，P-AKT的增加导致细胞核FOXO3因被磷酸化后移入胞质而减少，出核的FOXO3又容易被降解，所以胆脂瘤细胞核和细胞质中的FOXO3都比正常细胞少。而核FOXO3的减少导致Bim转录水平下降，Bim无法达到正常皮肤中的水平，则难以激活Bax/Bak诱发细胞凋亡，所以胆脂瘤中DAPI荧光也会变弱。综上所述，FOXO3/Bim通路对中耳胆脂瘤起到了抑制凋亡的作用。