张耀杰，朱海波，陈建军，唐耀平，庞伦祥，黄修解，凡永杰

（广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530000）

冠脉循环系统是由心外膜大血管、中间部分的前小动脉、远端部分的微小动脉组成，微小动脉直径小于100 μm，因此微小动脉在冠脉造影中不能显影[1]。冠状动脉微血管是冠脉循环的主要阻力血管，收缩与舒张功能是否正常直接关系到心肌的供血[2]。冠脉微循环疾病的发病机制有很多，包括结构性改变、功能性改变、内皮依赖的血管舒张改变、非内皮依赖性血管舒张的改变等[3]。研究证明氧化应激在冠脉微循环障碍发生发展中发挥着重要的作用，疾病或者应激状态下，内皮释放活性氧导致细胞功能障碍、血栓形成、纤维化[4]。有效防治冠脉微循环疾病对于心血管疾病的发展至关重要。

目前西医治疗具有时效性、容易反复。随着中医药的快速发展，相关研究表明活血化瘀中药可改善微循环功能[5-6]。西苑医院陈可冀院士团队认为，微循环障碍与血瘀证有一定关系，可采用“活血化瘀”治法进行治疗，临床上常用丹参、红花等传统中药。鸡血藤，与以往传统中药不同，是一味壮药，为豆科植物密花豆的干净藤茎，主要产于中国云南、广西等地，包含黄酮类、木脂素类、甾体类及萜类等多种化合物，具有保护心血管系统、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用[7-10]，成为现代临床研究的热点。本文通过网络药理学寻找鸡血藤治疗冠脉微循环疾病作用靶点和信号通路，采用分子对接技术验证成分与靶点的结合力，探讨鸡血藤治疗冠脉微循环疾病的机制。

1 材料与方法

1.1 鸡血藤活性成分与潜在靶点筛选 TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，2021-03-01）数据库以化合物口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 作为活性化合物的筛选条件，同时在该数据库检索鸡血藤的靶点信息，将活性成分对应的靶点输入Uniprot（https://www.uniprot.org，2021-03-02）数据库，整合、去重得到鸡血藤的潜在靶点。

1.2 作用靶点的获取 GeneCards（https://www.uniprot.org，2021-03-03）数据库检索关键词“Coronary microcirculation disease”得到冠脉微循环疾病作用靶点。在Venny2.1 在线软件作图工具平台上分别录入鸡血藤与冠脉微循环病变的靶点，绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.3 构建“鸡血藤－活性成分－作用靶点”网络 将上述得到的活性化合物和潜在作用靶点导入Cytoscape3.7.1 软件，构建“药物—成分—疾病—靶点”相互作用网络图。

1.4 GO、KEGG 富集分析 在R 软件安装Bioconductor 软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将鸡血藤—冠脉微循环疾病共同靶点转换成entrezID。然后在R软件安装“ClusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P＜0.05，Q＜0.05 进行关键靶基因GO 与KEGG功能富集分析。

1.5 分子对接 在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，2021-03-08）数据库中下载核心活性成分的mol2 文件，同时在PDB（https://www.rcsb.org/，2021-03-08）数据库中下载核心靶点的PDB文件，利用Auto-Dock 工具进行分子对接，了解靶点蛋白质与活性成分的结合方式。

2 结果

2.1 鸡血藤活性成分及潜在靶点预测 在TCMSP数据库中设定OB≥30%、DL≥0.18，对鸡血藤的有效成分进行筛选，共得到有效活性成分24 个，包括木犀草素、甘草查耳酮a、刺芒柄花素、β 谷甾醇、芦荟大黄素等。将活性成分对应的靶点输入UniProt 数据库，删除去重，共筛选出110个药物靶点。

2.2 作用靶点获取 以“Coronary microcirculation disease”为关键词在GeneCards数据库进行检索，去重后共获得疾病靶点897个。在Venny2.1在线软件作图工具平台上输入110个药物靶点、897个疾病靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物—疾病共同靶点63个，见图1。

图1 鸡血藤与冠脉微循环病变靶点韦恩图

2.3 药物－活性成分－疾病作用靶点网络构建与分析 将鸡血藤中24 个潜在活性成分与63 个药物－疾病共同靶点输入Cytoscape 软件中，绘制出“药物－成分－靶点－疾病”相互作用的网络图。图中紫色代表药物，蓝色代表鸡血藤中的23种活性成分（1 个活性成分靶点与疾病靶点无交集，予删除），绿色代表63个共同靶点，红色代表疾病。见图2。

图2 药物—成分—靶点—疾病作用网络图

2.4 GO 分析 将63 个共同靶点经R 语言运行后GO 分析选取生物学过程（BP）、细胞组分(CC)及分子功能(MF)3 个部分，每个部分展示显著富集的top20个，即p.adjust最小的20个，形成GO富集的条形图，见图3。图3A中富集的20条BP包括了DNA结合转录因子活性的调节（regulation of DNA-binding transcription factor activity）、细胞对药物的反应（cellular response to drug）、生殖结构发育（reproductive structure development）、生殖系统发育（reproductive system development）、氧化应激反应（response to oxidative stress）等。图3B 中富集的20 条CC 包括了膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、膜区（membrane region）、核染色质（nuclear chromatin）、囊泡腔（vesicle lumen）等。图3C 中富集的20 条MF 包括了细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）等。

图3 GO分析结果

2.5 KEGG 分析 将63 个共同靶点经R 语言运行后共得到147条KEGG通路，展示显著富集的top20个，即p.adjust最小的20个，形成KEGG功能富集的条形图，见图4。结合冠脉微循环疾病KEGG 主要富集于PI3K-Akt 信号通路、松弛素信号通路、FoxO信号通路、血小板活化、Wnt信号通路等。

图4 KEGG信号通路富集分析结果

2.6 分子对接结果 Degree 值即预测出成分与作用靶点的关联个数，Degree值越大说明该成分或者该靶点越重要，根据degree 值取前5 个核心进行分子对接，活性成分由高到低前5 个排序依次为木犀草素（luteolin）、甘草查耳酮（alicochalcone a）、刺芒柄花素（formononetin）、β谷甾醇（beta-sitosterol）、芦荟大黄素（aloe-emodin）。靶点由高到低前5个排序依次为丝氨酸/苏氨酸－蛋白激酶1（AKT1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、表皮生长因子受体(EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管内皮生长因子A（VEGFA）。通过Auto-Dock 工具对接，与AKT1、CASP3、EGFR、MAPK1、VEGFA这5个靶点对接最好的活性成分分别为licochalcone a、Betasitosterol、Beta-sitosterol、Beta-sitosterol、luteolin，对应的对接得分值为-7.75、-5.76、-10.74、-9.73、-5.46。此外也选取了Beta-sitosterol和AKT1对接、licochalcone a 和EGFR 对接、luteolin 和MAPK1 对接作为比较共同构成8 张对接图，见图5；对应的对接得分值为：-8.7、-9.43、-8.99。对接得分是评价两者结合能力的重要指标，Auto-Dock 工具对接得分负值＜5说明结合一般，对接得分负值在5～10之间说明结合较好，对接得分负值≥10说明结合非常好。

图5 核心成分和核心靶点分子对接图

3 讨论

冠脉微循环疾病是由于冠脉微循环结构和功能异常导致劳力性心绞痛或者心肌缺血的临床综合征[11]。目前认为磁共振成像被认为是无创性评定微循环障碍的有效的检查手段[12]。微循环疾病由多种发病机制引起，心肌细胞的炎症反应、氧化应激等主要参与其发展过程[13-14]。近年来西医治疗主要涉及控制危险因素、抗血小板聚集及降脂、抗心肌缺血等治疗方案[15]，虽有效但具有时效性，容易反复。中医药治疗临床报道增多，中医通过活血通络法改善冠脉微循环，缓解冠脉微循环疾病病症[16]。

鸡血藤系豆科植物密花豆的干燥藤茎，具有活血补血、舒筋活络的功效[17]。其中黄酮类化合物、有机酸类化合物在心血管系统有着明显的药理活性[18-21]。鸡血藤具有降低总胆固醇、抗氧化应激、抗血小板聚集等多方面作用[22-24]。本研究筛查出鸡血藤活性成分23个，根据Degree值得出核心成分包括木犀草素、甘草查耳酮a、刺芒柄花素、β 谷甾醇、芦荟大黄素等，其中木犀草素、甘草查耳酮a、刺芒柄花素属于黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗炎、改善血管的通透性、调节血脂、抑制血栓、抗氧化应激等作用[25]。芦荟大黄素属于蒽醌类化合物，具有抑制炎症反应作用。β 谷甾醇为甾醇类化合物，甾醇类化合物可以通过降低胆固醇的吸收（下调NPC1L1 表达）、促进肠道胆固醇排泄、减少胆固醇在肝内的合成等途径降低血脂[26]。

本研究得到潜在药物作用靶点63 个，通过GO分析发现，鸡血藤通过63个作用靶点参与到冠脉微循环疾病的多种生物学过程中。本研究通过KEGG分析得到通路共147条。其中主要涉及到PI3K-Akt信号通路、松弛素信号通路、FoxO信号通路、血小板活化、Wnt信号通路等通路。PI3K-Akt信号通路，对细胞存活、增殖、减少氧化应激等有着重要作用，促进PI3K-Akt 信号蛋白的表达可以改善心肌代谢及供血。松弛素信号通路，使得局部受体发挥心脏保护和细胞外基质调节作用，诱导NO生成，拮抗血管对ET-1、AngⅡ和儿茶酚胺的收缩反应，增加心输出量，改善心肌缺血。FoxO 信号通路，主要参与调整细胞的增殖、分化和凋亡。Wnt信号通路，可活化核因子（NF-κB）促使血管内皮细胞炎性反应的发生、促进细胞凋亡。这些通路和冠脉微循环疾病有着密切联系，鸡血藤的活性成分通过63个靶点作用于以上通路发挥治疗冠脉微循环疾病的作用[27]。最后结合分子对接结果进一步验证成分和靶点具有较强的结合力。

综上所述，网络药理学与中药多成分—多靶点、多通路的作用特点一致[28]，运用网络药理学对药物进行靶点、通路预测，得到鸡血藤治疗冠脉微循环疾病的潜在靶点及通路，为以后临床开展冠脉微循环疾病中医治疗奠定了理论基础，但仅通过潜在靶点、信号通路研究存在一定局限性，后期有待实验验证。