陈巧玲，白亦光

（川北医学院第二临床医学院四川省南充市中心医院 1.肿瘤科：2.骨科，南充 637000）

结肠癌是40～50 岁年龄组常见的消化道恶性肿瘤，好发生于结肠部位，占胃肠道肿瘤的第3位[1]。结肠癌是与遗传因素和饮食习惯密切相关的疾病，严重影响国民的生命健康。目前结肠癌的发病率仍在逐年升高，由于其早期发现率低，晚期死亡率高，患者预后较差[2]。对于结肠恶性肿瘤治疗方式仍然是以化疗和手术为主[3]。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种抗代谢类嘧啶类似物，是临床常用的肿瘤化疗药物[4]。但由于个体差异或肿瘤细胞易耐药等原因，有些患者的治疗效果并没有达到理想的状态[5]。因此，需要不断尝试更好的治疗策略来治疗结肠癌。色素上皮衍生因子（PEDF）是一种属于非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的内源性糖蛋白，具有很强的神经分化活性。近年来发现，PEDF 具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长等多种功能[6]。因此，补充PEDF 蛋白和（或）增强内源性PEDF表达可能是治疗癌症的一种新的治疗策略。本研究旨在观察PEDF 联合5-FU在体外共同干预CT26细胞株以及在体内治疗结肠癌荷瘤小鼠模型的效果，为结肠癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 小鼠结肠癌CT26 细胞（中科院上海细胞库，中国）。RPMI 1640 细胞培养液（Sigma）；胎牛血清（FBS）和胰酶（Thermo 公司，美国）；5-FU（江苏豪森医药公司，中国）；Transwell 小室（直径为6.5 mm，孔径为8 μm；Corning 公司，美国）；酶标仪（Thermo公司，美国）；原位凋亡检测（TUNEL）试剂盒（Promega 公司，美国）；重组小鼠PEDF 蛋白（Abcam 公司，英国）。低温离心机（Eppendorf 公司，德国）；荧光倒置显微镜（Olympas公司，日本）。

1.2 细胞培养 分离CT26 细胞株至T75 培养瓶，添加含10%FBS的RPMI 1640完全培养基，将细胞瓶置于恒温培养箱中培养，待细胞融合度达到80%以上时，采用0.25%的胰蛋白酶消化，传代培养。

1.3 实验动物 BALB/c 雌性小鼠24 只购于川北医学院实验动物中心，4～6周龄，体重18～20 g，无特定病原体条件下饲养于川北医学院实验动物中心。小鼠饲养在温度22～25 ℃，湿度55%的SPF 动物房中。将小鼠饲养在独立通气笼（IVC 笼）中，12 h/12 h明暗交替，动物自由摄食、饮水。

1.4 划痕实验检测细胞迁移能力 收集CT26细胞接种于6孔板中，添加细胞5×105个/孔，培养至融合度90%，使用移液枪头在6孔板细胞上划痕，PBS液清洗2 次，将细胞分为对照组、5-FU 组和PEDF+5-FU 组。分别加入1 mL PBS、1 mL（5 μg）5-FU、0.5 mL（50 μg）PEDF+0.5 mL（2.5 μg）5-FU，每组各加入原培育基1 mL，每组均设2 个复孔。分别0 h、24 h显微镜下观察并照相，测量记录划痕间距离，实验重复5次，取平均值记录。

1.5 Transwell 迁移实验 将Transwell 小室置于24孔板上，分为3组，每组设置3个复孔。收集无血清饥饿12 h 的CT26 细胞，在每组上室均加入无血清细胞悬液2×105/100 μL。各组上室中分别加入100 μL PBS、100 μL（5 μg）5-FU、50 μL（50 μg）PEDF+50 μL（2.5 μg）5-FU，下室加1640 培养液（含10%FBS）500 μL，恒温培养箱中培养24 h，取出小室，PBS冲洗后甲醛固定30 min，结晶紫染色5 min，选10 个视野在显微镜下计数穿透细胞数并计算均值。

1.6 小鼠结肠癌皮下瘤模型的建立 将浓度为1×106个/mL 的CT26 细胞于小鼠背部皮下注射皮丘，剂量为0.5 mL。每5日测量一次肿瘤体积来观察肿瘤大小，计算公式为肿瘤体积=肿瘤宽度2×肿瘤的长度×0.52。当小鼠肿瘤体积大约为150 mm3时，荷瘤小鼠模型用于后续实验过程[7]。所有动物实验均在川北医学院动物伦理委员会监督下进行。

1.7 小鼠分组及治疗 将24 只BALB/c 小鼠结肠癌皮下瘤模型随机分为3 组，每组8 只。对照组给予100 μL PBS，5-FU组给予腹腔注射20 mg/kg的5-FU，PEDF+5-FU组给予同时静脉注射12.5 mg/kg的PEDF 蛋白和腹腔注射20 mg/kg 的5-FU 注射液。隔日给药，共给药3 次。给药后第20天处死荷瘤小鼠，手术游离肿瘤组织后放入10%甲醛溶液中固定，病理组织切片后进行后续实验。

1.8 CD31免疫荧光染色检测肿瘤组织微血管密度取出肿瘤组织冰冻组织切片，室温下放置30 min后，用0.5% TritonX-100（PBS 稀释）通透20 min。将切片置于湿盒中（保持组织呈湿润状态），滴加正常山羊血清，室温封闭30 min。将封闭液吸干后，滴加适当比例稀释的抗CD31 单克隆抗体（一抗，1∶1 000），4 ℃冰箱孵育过夜。PBS清洗3次，5 min/次。加入荧光标记的二抗（1∶1 000），37 ℃避光孵育30 min。PBS 清洗3 次，5 min/次。用DAPI 复染肿瘤细胞核5 min，PBS 清洗3 次，用防荧光淬灭的封片剂封片，荧光显微镜下观察红色荧光的表达并采集图像，使用Image J 5.0 软件定量分析相同视野下CD31 免疫荧光的数量，从而间接测定微血管的生成密度。

1.9 TUNEL染色观察肿瘤组织细胞凋亡情况 准备好肿瘤标本石蜡切片，脱蜡至水，PBS 洗涤3 次，根据TUNEL检测试剂盒说明书进行操作。使用抗荧光淬灭封片液封片后，在荧光显微镜下观察。在5个随机区域内随机选择的视野中的呈现出绿色荧光的凋亡细胞核数量进行定量。通过凋亡细胞/肿瘤组织细胞的比值计算凋亡率。

1.10 统计学方法 采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组CT26 细胞迁移能力的比较 与对照组相比，5-FU组和PEDF+5-FU组CT26细胞迁移能力显著降低（P＜0.05）；与5-FU组相比，PEDF+5-FU组细胞迁移能力显著降低（P＜0.05），见图1、图2。

图1 划痕实验检测各组细胞迁移能力

图2 Transwell小室检测各组细胞迁移能力（标尺=50 μm）

2.2 荷瘤小鼠肿瘤体积和体重的变化 与对照组相比，5-FU 组和PEDF+5-FU 组肿瘤体积显著减小（P＜0.05）；与5-FU组相比，PEDF+5-FU组抑制效果更加明显（P＜0.05）。通过每5 天对荷瘤小鼠体重测量1次来评价小鼠毒副反应。在实验过程中，3组荷瘤小鼠体重未见明显差异（P＞0.05），见图3。3组小鼠习性均无特殊改变，无意外死亡。

图3 3组小鼠肿瘤体积和体重变化

2.3 肿瘤组织中内皮细胞CD31表达的情况 CD31免疫荧光染色检测肿瘤组织中微血管密度，CD31为内皮细胞的特异性抗原，表达于内皮细胞膜表面。如图4所示，PEDF+5-FU组微血管数量较对照组和5-FU 组明显减少（P＜0.01），而对照组和5-FU组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 免疫荧光检测各组CD31的表达（标尺=50 μm）

2.4 组织中肿瘤细胞凋亡的情况 5-FU组和PEDF+5-FU组绿色荧光着色的细胞核明显多于对照组，表明凋亡细胞的数量明显多于对照组（P＜0.05），且PEDF+5-FU 组细胞凋亡率高于5-FU 组（P＜0.05），见图5。

图5 TUNEL法免疫荧光染色法检测对细胞凋亡的影响

结肠癌是消化系统常见的肿瘤之一，经过多年的实验和临床研究，虽然取得了一定的研究成果，但结肠癌的发病机制仍不十分清楚，但临床已经证实其病因是多因素的，如肥胖、吸烟、饮食习惯和家族癌症遗传都是增加患癌的风险因素，目前的治疗策略仍然是以化疗和手术为主。其中5-FU 是针对消化道肿瘤的一个重要的化疗药物。

5-FU在体内先降解成氟尿嘧啶脱氧核苷酸，从而发挥效应影响DNA合成，也能在体内降解为氟尿嘧啶核苷干扰RNA 合成，进而影响蛋白质合成[8]。由于5-FU是根据人为合成的抗代谢类药物，并在临床上取得了良好的成效，尤其是对消化道肿瘤有良好治疗效果，在肿瘤内科化疗应用较为广泛[9]。

但是单纯的化疗药物总是会出现各种副反应，随着肿瘤的耐药常常会对早期的良好治疗效果产生一定影响，所以肿瘤治疗过程中需要有新的思路。抗血管生成疗法是有广阔前景的近年来兴起的肿瘤治疗策略之一。肿瘤组织的生存也必需依赖新生血管形成。血管内皮细胞和肿瘤细胞之间存在相互调节作用。所以，如何将血管生成抑制剂同传统化疗药物共同协同作用治疗肿瘤，从而阻断肿瘤继续生长的血供来源而产生杀灭肿瘤，进一步增强传统的化疗药物对肿瘤细胞本身的杀伤作用，是笔者需要思考的课题。

本研究通过体外划痕实验及Transwell 实验表明，与对照组相比，5-FU 组和PEDF+5-FU 组CT26细胞的迁移能力显著降低（P＜0.05）。为了评价PEDF+5-FU药物在小鼠体内对肿瘤的治疗作用，本研究建立了结肠癌CT26荷瘤小鼠模型，结果显示，与对照组相比，5-FU 组和PEDF+5-FU 组内肿瘤生长的速率明显减缓（P＜0.05），且PEDF联合5-FU对肿瘤组织生长抑制的效果更加明显（P＜0.05）。CD31 免疫荧光染色提示，PEDF+5-FU 组肿瘤组织中的微血管数目较对照组及5-FU 组明显减少。TUNEL 凋亡检测结果提示，5-FU 组和PEDF+5-FU组绿色荧光着色的细胞核明显多于对照组，表明凋亡细胞的数量明显多于对照组，且PEDF+5-FU组凋亡细胞最多（P＜0.05）。以上研究结果均提示PEDF联合5-FU在体内发挥较好的协同治疗作用。

研究表明，PEDF 在肿瘤的表达水平与肿瘤生长和转移呈负相关关系[10]。在体内主要是通过抑制肿瘤血管新生从而造成肿瘤细胞营养不足，进而出现凋亡[11]。本实验利用CD31 在新生血管中特异性表达，故而间接测定微血管的生成密度。Filleur等[12]分析了PEDF的分子结构并确定了一个潜在的表面受体结构域。此外，Abe 等[13]通过稳定转染建立PEDF 过表达的黑色素瘤细胞，体外实验显示被转染的肿瘤细胞增殖率明显下调。因此，PEDF 在体内和体外同时具有促使肿瘤细胞凋亡的作用，在本实验中也观察到肿瘤细胞染色质凝聚和核碎裂，诱导细胞凋亡的现象。两种药物的联合治疗可以在保证治疗效果的前提下减少化疗药物的剂量，进而降低药物的毒副反应。本研究证实了将抗血管生成治疗药物与化疗药物联合应用可以在体内、体外均起到协同抗肿瘤的作用。

综上所述，PEDF 在5-FU 的基础上可抑制结肠癌组织周围血管的生成，增加肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的作用。