不同实验室间测定单胃动物饲料样品总能的一致性及可加性研究

2021-07-12张晋源王钰明杜中原李黛淋王跃丽黄庆华杜青之黄艳玲

动物营养学报 2021年6期

张晋源王钰明杜中原董莹李黛淋王跃丽黄庆华杜青之黄艳玲赵峰*

(1.西南民族大学畜牧兽医学院，成都610041；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；3.温氏食品集团股份有限公司，云浮527400；4.新希望六和股份有限公司，北京100102； 5.唐人神集团股份有限公司，株洲412000；6.青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛266000； 7.湖南中本智能科技有限公司，长沙410013)

无论是生物学法或体外消化法评定饲料的有效能值，饲料、粪、尿样及未消化残渣的总能(GE)都是必需测定的数据，其变异可能直接影响有效能值的准确性，从而影响不同实验室测定饲料有效能值的可比性。因此，比较不同实验室间在样品GE测定上的差异程度非常重要。目前，在GE的测定上，我国仅有煤的发热量测定国家标准(GB/T 213—2008)[1]。而动物饲料及粪、尿样品GE的测定参考国际标准(ISO 9831:1998)[2]，其实验室间的重复性变异系数和再现性变异系数因样品不同分别在0.09%～2.10%和0.59%～4.71%变化。Bourdillon等[3-4]的试验结果表明，不同实验室测定饲粮GE的变异系数因样品不同在0.29%～1.79%变异。Pérez等[5]也得出不同实验室测定饲粮GE的变异系数为1.0%。然而，在上述试验中，用于测定GE的氧弹热量计型号未详细列出。Sibbald等[6]发现同一氧弹热量计在不同的测定模式下GE的测定值存在较大差异。杜中原等[7]的数据表明，在同一实验室条件下不同生产商提供的氧弹热量计在测定饲料、粪样的GE及变异程度上均存在明显的差异。这些客观存在的变异必将导致不同实验室间测定GE存在更大的变化，然而，其变异程度鲜见相关报道。为此，本研究在6个实验室间使用2种氧弹热量计测定饲料样品的GE，从而比较不同实验室间GE测定的差异及变异程度，为饲粮GE的测定准确度提供参考。

1 材料与方法

1.1 饲料原料及饲粮

选用玉米、小麦麸、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油为代表性饲料原料样品，其概略养分见表1。

表1 饲料原料的概略养分(绝干基础)

饲粮1～5由玉米、小麦麸、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油以及膨润土中的2～7种原料组成，形成一系列GE梯度相差约0.418 MJ/kg的饲粮；饲粮6～10在饲粮1～5基础上添加4%的预混料(维生素和微量元素的添加量参考王亚等[9])等比例替代原饲粮，其组成见表2。除大豆油外，所有样品粉碎(粉碎机型号：XT-A400；生产商：永康市红太阳机电)后过40目方形筛孔，于-20 ℃密封保存备用。

表2 饲粮组成(绝干基础)

1.2 试验设计

本试验分为2个部分。内容一：考察饲料的上样量对氧弹热量计测定GE值的影响，以确定GE测定值相对稳定的适宜上样量。对6个饲料原料和10个饲粮采用单因素完全随机设计，上样量设5个处理水平，即0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g，每个处理采用PARR-6400氧弹热量计重复测定4次。内容二：考察6个实验室测定饲料原料、饲粮GE的实验室间变异度及饲料原料间GE的可加性。根据内容一结果上样量统一为0.8 g。采用单因素完全随机设计，将6个饲料原料和10个饲粮各100 g发至6个实验室。其中实验室1～4采用PARR-6400型氧弹热量计，实验室5、6采用IKA C-2000型氧弹热量计。各实验室对每个样品测定4个重复。

1.3 测定指标与方法

按GB/T 6435—2014[10]测定样品的水分含量并计算其干物质含量。按GB/T 6432—2018[11]、GB/T 6433—2006[12]、GB/T 6438—2007[13]测定饲料的粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量。饲料及饲粮的GE的测定根据ISO 9831:1998[2]的方法进行。考虑到粉状样品在燃烧时容易抛洒，从而导致燃烧不充分的几率增加，因此，采用Whatman镜头纸(型号：2105-841)包裹饲料样品。在测样前，先称量10张镜头纸的总重量(>0.7 g)，然后在氧弹热量计中测定镜头纸的GE值。测定样品GE时分别称量镜头纸和样品的质量，在氧弹热量计的参数中输入镜头纸的质量及每克的能值，以便测定样品GE时予以扣除。所有实验室按照相同说明进行操作。

预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：VA 1 500 IU，VD3170 IU，VE 11 IU，VK30.5 mg，VB11.0 mg，VB22.5 mg，VB61.0 mg，VB1211 μg，泛酸 pantothenic acid 8.0 mg，烟酸 nicotinic acid 10.0 mg，叶酸 folic acid 0.3 mg，生物素 biotin 0.05 mg，氯化胆碱 choline chloride 350 mg，Cu(as copper sulfate)4.5 mg，Fe(as ferrous sulfate)70 mg，Zn(as zinc sulfate)70 mg，Mn(as manganese sulfate)3 mg，Se(as sodium selenite)0.3 mg，I(as calcium iodate)0.14 mg，NaCl 3 g，石粉 limestone 9.1 g，磷酸氢钙 CaHPO47.8 g，膨润土 bentonite 18.1 g。

1.4 数据处理与统计分析

饲粮GE计算值公式如下：

式中：Gk为某组分的GE值(干物质基础)；Pk为组分在该饲粮中的比例(干物质基础)。

采用SAS 9.2的MEANS模块计算基本统计量。根据单因素试验设计的原理，用GLM模块分析上样量对GE测定值的差异，并采用Contrast语句进行GE测定值对上样量的一次、二次关系检验。根据GB/T 28043—2019[14]和吴旻[15]的描述计算稳健统计Z比分数。根据GB/T 6379.2—2004[16]的描述计算实验室间一致性检验统计量曼德尔h和k值，并计算GE测定值的重复性、实验室间及再现性变异系数。通过GLM模型分析实验室间GE测定值的差异显著性；采用REG模块将饲粮1～10实测的GE值对计算的GE进行线性归回，采用TEST语句检验斜率与1，截距与0的差异显著性；采用配对TTEST检验GE计算值与测定值的差异显著性。从而检验饲料原料间GE测定值在饲粮中是否可加。统计量的计算公式[16]如下：

2 结果与分析

2.1 上样量对饲料样品GE测定值的影响

由表3可知，6个饲料原料及10个饲粮的GE测定值均随上样量的增加而呈显著线性和二次曲线增加(P<0.05)。0.2 g上样量样品的GE测定值均显著低于0.4～1.0 g上样量相应的GE测定值(P<0.05)。除大豆油和饲粮3以外，0.4 g上样量测定的样品GE测定值均显著低于0.8～1.0 g上样量相应的GE测定值(P<0.05)。在0.6～1.0g上样量间，样品GE测定值相对差异较小。

表3 不同样品的上样量对GE测定值的影响

2.2 不同实验室间测定饲料及饲粮GE值的一致性检验

由图1可知，从实验室GE测定值的Z比分值看，实验室2有2个样品的|Z|>3，实验室5有2个样品的|Z|>3，实验室6有1个样品的|Z|>3。实验室1、3、4的|Z|均在2以内。

实验室1～4采用PARR-6400型氧弹热量计，实验室5～6采用IKA C-2000型氧弹热量计测定GE。下图同。

由图2可知，从实验室GE测定值一致性检验的曼德尔h统计量看，实验室2的测定结果偏低，而实验室5的测定结果偏高。实验室4的测定结果最接近实验室间的平均值。实验室1和3的测定结果与实验室间的平均值相对接近。从实验室GE测定值一致性检验的曼德尔k统计量看，实验室5和6的测定结果变异度接近，且高于实验室1、2、3、4。实验室1、2、3、4的变异度相对接近。

图2 6个实验室间测定饲料GE的曼德尔h和k统计量

由表4可知，在6个实验室测定6个饲料原料和10个饲粮GE的多重比较中，实验室3和5各有12个样品的GE测定值最高，实验室2有14个样品的GE测定值最低，实验室1有9个样品的GE测定值偏低。而实验室4和6的GE测定值最大或最低的样品数量少于5个。GE测定值的重复性变异系数在0.09%～0.31%，实验室间变异系数在0.28%～0.61%，再现性变异系数在0.29%～0.64%。

表4 不同实验室测定样品GE的变异

2.3 不同实验室间饲粮GE测定值的可加性

由表5可知，实验室1、3、5和6对10个饲粮GE的计算值与测定值相差分别为-0.05～0.11 MJ/kg、-0.05～0.27 MJ/kg、-0.07～0.20 MJ/kg和-0.12～0.06 MJ/kg，配对t检验差异不显著(P>0.05)。而实验室2和4对10个饲粮GE的计算值与测定值相差分别为-0.01～0.17 MJ/kg和0.00～0.18 MJ/kg，配对t检验差异显著(P<0.05)。6个实验室测定10个饲粮的GE测定值对计算值的线性回归模型中，斜率与1均无显著差异(P>0.05)，截距与0均无显著差异(P>0.05)。

表5 不同实验室饲粮GE测定值与计算值的差异

3 讨论

3.1 上样量对氧弹热量计GE测定值的影响

氧弹热量计测定饲料GE的原理是根据样品燃烧后释放出来的热量被水吸收，通过测定水温升高幅度计算样品的GE值[2]。由于氧弹、点火丝等金属材料也可以吸收热量，因此，采用苯甲酸标准品标定其热容量。当上样量较低时释放出来的总热量低，水温升高幅度也低，而氧弹、点火丝等金属材料吸收热量占比相对较高，从而大大降低了测定的准确性。ISO 9831—1998[2]规定上样量以燃烧后水温升高2～3 ℃为参考，称样重量取决于样品的能值和氧弹热量计的有效热容量，其推荐一般样品的上样量为1 g。然而，在实际测定中，样品(如食糜、体外消化残渣等)的数量有时难以达到规定的重量要求，或样品能值及密度偏低，坩埚容量不足以装载规定重量的样品，有些研究者采用添加助燃剂如苯甲酸[17]、矿物油等以使燃烧后温度升幅达到仪器规定的范围。然而，目前在测定猪、鸡、鸭饲粮、粪样或体外消化水解残渣的GE值中，鲜见关于上样量的详细描述[18]，而在实际操作中不同实验室间在上样量上可能大相径庭。本研究中无论是饲料原料还是饲粮，其上样量在0.2～0.6 g时GE测定值均随上样量的增加而升高，而在0.6～1.0 g时GE测定值相对稳定，这表明随着上样量的增加，水温升幅增加，氧弹吸收的热量占比下降，从而使样品GE测定值趋稳。这一现象与马艳等[19]使用PARR-6300测定玉米的GE在上样量低于0.5～0.7 g变化时测定值逐步增加并趋稳的结论类似，与杜中原等[7]使用PARR-6400型氧弹热量计测定玉米GE与上样量的关系也相似。上述结果表明，在饲料样品GE的测定中，上样量不应低于0.6 g。

3.2 实验室间氧弹热量计测定GE值的变异及可加性

目前国内饲料企业测定饲料GE主要采用美国PARR、德国IKA及长沙奔特等不同厂家生产的氧弹热量计。不同生产商制造的氧弹热量计在构造、GE的计算原理上均存在某些差异。通过苯甲酸标准品校正可以减少不同型号仪器间的差异。在实验室间测定结果一致性的统计学评判上，通过Z比分值考察实验室间测定的异常值[14-15]，而曼德尔h和k统计量分别表示实验室间测定值的偏差程度及实验室内的变异程度[16]。根据|Z|≤2，测定值满意；2<|Z|<3,测定值“有问题”；|Z|≥3，测定值“不满意”的评判准则[15]，本研究中实验室2有2个样品测定值“不满意”；实验室5有2个样品GE测定值“不满意”；实验室6有1个样品GE测定值“不满意”。这些样品并未呈现特定的某1个或几个样品。上述实验室间96个数据比较中，91个数据的一致性是满意，比例达到94.8%。曼德尔h统计量表明,实验室2和5的GE测定值偏离了实验室间的平均测定值。综合Z比分值和曼德尔h统计量，提示实验室2、5、6在GE的测定上需要加强测定过程的控制。曼德尔k统计量表明，实验室5和6测定GE的变异相对偏高，这可能与这2家实验室采用的氧弹热量计的型号不同于实验室1～4有关，这一现象与杜中原等[7]比较2种型号的氧弹热量计测定饲料及粪样GE的变异度存在差异的结论相似。本研究中16个样品GE测定的重复性、实验室间及再现性变异系数均在0.64%以内。这一变异程度比ISO 9831:1990[2]在剔除部分实验室异常测定值后7类样品GE测定值的重复性变异系数小于2.10%的范围小；比Bourdillon等[3-4]报道的不同实验室测定饲粮GE的变异系数小于1.79%及Pérez等[5]得出不同实验室测定饲粮GE的变异系数为1.0%都低。这表明参与本研究的6个实验室在测定饲料样品GE的变异度是相对较低的。

目前在饲料配方中，饲粮的可消化养分的含量都是根据原料的可消化养分含量线性可加计算的。从方法学的角度看，可加性是方法成立的基本原则[20-21]。在检验某一测定方法是否具有可加性的手段上，通常采用以下2种统计方法：1)t检验比较混合样品的实测值与根据混合样品各成分的实测值及组成比例获得的计算值是否相等[22-23]；2)根据混合样品的测定值对计算值的线性关系是否与Y=X重叠[24]。本研究中6个实验室内10个饲粮的GE测定值对计算值的回归与Y=X均重叠，4个实验室配对t检验得出GE测定值与计算值无显著性差异，但2个实验室(2和4)GE测定值显著低于计算值。这表明大多数实验室内饲料间GE的可加性是非常满意的。