姬笑颜 李含笑 杨艳妮 张欣怡 苏明莉 刘西纺，3△

骨质疏松症是以骨量减少，骨微组织结构破坏，导致骨骼脆性增加，骨折的发生率增高为特征的全身性骨病[1]。骨质疏松症由遗传、营养、性腺功能减退、增龄等多种因素引起，机体免疫功能障碍与全身炎症激活也被证实与骨质疏松症的发病密切相关，因此抗炎和免疫调节成为治疗骨质疏松症的新思路[2-5]。瑞香素(Daphnetin，DAP)又名祖师麻甲素，是从长白瑞香等瑞香科属植物中提取出来的香豆类衍生物，是一种具有抗炎作用的天然药物，传统多用于稀痘、乳痈初起等炎性疾病的治疗[6]。瑞香素在骨质疏松症治疗中的作用尚未见报道，本课题组在前期的体外研究中发现瑞香素对骨髓源性巨噬细胞(BMM)来源的破骨细胞形成有明显的抑制作用，而且能抑制RANKL诱导的巨噬细胞 NF-κB、Akt/GSK-3β途径的活化，表明瑞香素对RANKL诱导的破骨细胞生成具有抑制作用[7]，且瑞香素在其他相关疾病的治疗中发挥抗炎、抗氧化、免疫调节等作用[8-13]。本研究拟观察瑞香素对绝经后骨质疏松大鼠的炎性因子和骨代谢指标的影响，以进一步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物

健康清洁级SD大鼠60只，雌性，体质量(220±20)g，西安交通大学实验动物中心提供，实验动物许可证号为SCXK(陕)2018-001。

1.2实验药物及试剂

瑞香素胶囊购自吉林省西点药业科技发展股份有限公司，国药准字H22024043，产品批号为03190101，规格0.15 g/粒。阿仑膦酸钠片购自杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130085，生产批号为S016727，规格70 mg/粒。羟甲基纤维素钠购自湖北远成赛创科技有限公司。Ca、P、ALP、IL-6、TNF-α检测试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.3实验仪器

双能X线骨密度仪(ASY-00409)，美国Hologic公司。Multiskan FC型酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.4方法

1.4.1造模方法 除空白组外，均进行去势造模，用5%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，剂量为0.6 mL/100 g，消毒进行注射，待麻药起效大鼠进入麻醉状态后在无菌条件下行背部单切口入路卵巢切除术。背部备皮消毒，用剪刀在背部正中肋弓下1 cm与背部后正中线的交点切开长约1～2 cm纵行切口，找到卵巢(肾脏后下方脂肪组织周围粉红色样组织)，分离卵巢周围脂肪组织，结扎输卵管及血管后将卵巢切除，后逐层缝合，在伤口处皮下注射青霉素预防感染，右侧手术同左侧，最后检查止血，清点手术器械。造模后8周开始进行药物干预。

1.4.2分组方法 实验动物用随机数字表法分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组、模型组、空白组6个实验组，每组10只。按照常规笼养，标准饲料喂养，自由饮水。

1.4.3干预方法 根据设计的药物剂量和体积，称取适量的药粉，用0.5%的羟甲基纤维素钠悬浮并稀释至合适的浓度，现配现用。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别予以瑞香素0.275、 0.463、0.668 mg/kg灌胃，1次/d；对照组阿仑膦酸钠剂量0.630 mg/kg，1次/周；模型组0.9%生理盐水0.668 mg/kg灌胃；空白组不干预；连续给药12周。实验过程中每周称1次体质量，根据体质量调整给药剂量。

1.4.4实验指标测定 1)骨密度检测：将大鼠麻醉后，仰卧位测全身骨密度。2)血清IL-6、TNF-α、Ca、P、ALP的表达检测：用5%水合氯醛，0.6 mL/100 g将大鼠麻醉，仰卧固定在手术架上，沿腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露。用采血针快速采全血约5 mL，静置30 min，4 ℃，3 000 r/min离心20 min分离血清，使用生化试剂盒和ELISA试剂盒，按照说明书进行检测。

1.5统计学方法

2 结果

2.1造模前后各组大鼠的一般情况对比

本实验选用去卵巢法模拟绝经后骨质疏松模型，7～12周即可形成模型[13]。造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)，造模8周后各组大鼠体质量与空白组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组大鼠间BMD比较

治疗前空白组大鼠BMD高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后各组大鼠的BMD均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组、对照组的BMD治疗后均高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 治疗前后各组大鼠BMD变化

2.3瑞香素对各组大鼠炎性因子的影响

低剂量组、高剂量组和空白组IL-6含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组、中剂量组、高剂量组和模型组的IL-6含量均高于空白组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组、高剂量组、对照组和空白组TNF-α的含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组、中剂量组和模型组的TNF-α含量均高于空白组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 瑞香素对各组大鼠炎性因子的影响

2.4各组大鼠血清Ca、P、ALP表达的比较

高剂量组Ca含量高于对照组和模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组、高剂量组P含量均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；中剂量组、高剂量组、对照组ALP含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组ALP含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠血清Ca、P、ALP表达的比较

3 讨论

3.1骨质疏松症和BMD

骨质疏松的发生是骨形成和骨吸收之间的失衡，吸收超过形成引起骨量的减少BMD降低，BMD是反映骨骼强度的重要指标[14]。本研究发现瑞香素灌胃后各组大鼠的BMD均高于模型组(P<0.05)。除了模型组，其余各组大鼠的BMD治疗后均高于治疗前，瑞香素高剂量组、对照组大鼠的BMD治疗后高于治疗前(P<0.05)，可见高剂量的瑞香素可有效提高大鼠的BMD，增强骨骼强度，延缓骨质疏松的进程。

3.2炎性因子与骨质疏松症

炎症是疾病发生发展的重要生物学过程，女性绝经后失去雌激素保护，大量的炎性因子积累，如IL-6、TNF-α、IL-12等，这些炎性细胞因子可调节氧化应激损伤，引起破骨细胞骨吸收增强，导致骨重建失衡[15-17]。IL-6作用于成骨细胞的基质细胞，刺激破骨细胞形成，增加并增强破骨细胞活性，促进骨吸收，进而参与到骨质疏松的形成过程[18]。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞的过程中发挥重要作用，TNF-α可直接或间接促进M-SCF的产生，作用于破骨细胞加速骨吸收，并使成骨的凋亡加快，减少骨的合成，且在骨质疏松性疼痛中发挥重要作用[19-20]。代婵等[21]发现瑞香素在TNF-α诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)中NF-κB信号通路活化，降低NF-κB信号通路中P65的磷酸化水平，调节相关炎症因子的分泌，减少炎症反应。何荣安等[22]发现瑞香素可通过NF-κB信号通路抑制p65的磷酸化，减弱TNF-α刺激的HaCaT角质形成细胞炎症因子的表达。本研究发现在瑞香素干预12周以后低剂量组、高剂量组、空白组IL-6含量均低于模型组(P<0.01)，低剂量组、高剂量组、对照组和空白组TNF-α的含量均低于模型组(P<0.05)，也进一步证明了瑞香素可缓解绝经后骨质疏松大鼠的炎症反应，改善骨痛，进而对大鼠的骨代谢产生影响。

3.3瑞香素对骨代谢的影响

骨代谢生化指标包括骨转换标志物、钙磷代谢指标、激素与细胞因子，通过骨代谢生化指标可了解骨组织代谢[23]。骨组织中钙、磷的含量是维持骨组织强度的基础，血清中钙、磷的含量是反映全身骨组织代谢的重要指标。ALP是参与骨代谢的重要蛋白，可直接反映成骨细胞的活性和功能状况，亦与钙磷的代谢具有密切关系[24]。本研究结果显示瑞香素高剂量组Ca含量高于对照组和模型组(P<0.05)。低剂量组、高剂量组P含量均高于模型组(P<0.05)；低剂量组、高剂量组、对照组P含量均高于空白组(P<0.05)。可见瑞香素可在一定程度上提高骨质疏松大鼠骨组织中的钙磷含量，从而增强骨组织的强度。谌红珊等[25]研究发现骨质疏松患者的ALP水平与BMD呈负相关。本研究发现瑞香素中剂量组、高剂量组ALP含量均低于模型组(P<0.05)，说明中、高剂量的瑞香素可降低去卵巢骨质疏松大鼠的ALP含量，提高其钙磷含量，改善去卵巢骨质疏松大鼠的骨代谢水平。

综上所述，瑞香素高剂量可提高绝经后骨质疏松大鼠的全身BMD，低剂量和高剂量的瑞香素均对IL-6、TNF-α有明显的抑制作用，高剂量的瑞香素可提高血清Ca的含量，中、高剂量的瑞香素可提高血清P的含量，中、高剂量可有效降低ALP的含量进而可维持骨组织的强度，抑制骨质疏松的严重程度，这对临床上治疗绝经后骨质疏松提供了实验基础，但其具体的作用机制有待进一步的研究。