展嘉文 朱立国 王尚全△ 魏戌 刘广伟 王晓博 王文轩 谢瑞 韩涛 陈明 尹煜辉

腰椎小关节骨性关节炎(Lumbar Facet Joint Osteoarthritis，LFJOA)是引起下腰痛的常见原因之一[1]。针对本病的治疗目前多以消炎止痛为主[2]，但对退变小关节组织本身未能起到改善作用，新的生物学治疗目标是在抑制炎症反应的同时阻止或延缓关节退变，从而彻底缓解腰痛等临床症状[3-4]。

前期笔者通过离体组织研究显示含有丹参水溶性成分的含药血清能够延缓腰椎运动节段组织退变[5]，进一步通过网络药理分析发现丹参水溶性入血成分丹酚酸A (Salvianolic Acid A，SAA)能够从多靶点治疗LFJOA。最新研究已证实SAA能够显著延缓骨关节炎退变进程[6]，而SAA是否能在LFJOA的治疗中发挥效用需要进一步验证。

据此，本研究将通过已建立的在体加压模型[7]，观察丹酚酸A对LFJOA的干预作用，为进一步拓展该中药单体制剂的适应证与应用范围提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

4～6个月龄健康新西兰兔24只，雌雄不限，2.5～3.0 kg左右(中国中医科学院实验动物中心提供)，根据随机数表法随机分3组，每组8只，即对照组、模型组、丹酚酸组。

1.2模型建立与取材

在Kroeber等[7]的造模方法基础上设计了在体加压装置，利用此装置建立了在体兔脊柱运动节段压力退变模型(见图1)。建立过程为将实验兔背部备皮麻醉后将其固定于俯卧位，1.5 mm直径克氏针在冠状面分别经皮横穿L4、L5腰椎，在椎旁两侧做直切口显露克氏针，将加压装置通过连接杆套入克氏针，剪断克氏针过长部分埋于肌肉内，分层缝合手术切口。在体外加压装置上安装弹簧，通过调节弹簧长度设定294 kPa压力。对照组：依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜后，缝合切口。造模完成后，所有动物均饲养于室温、通风良好的环境中，自由进食、饮水。

图1 在体兔脊柱运动节段压力退变模型

丹酚酸组腹腔注射40 mg/kg丹酚酸A(购于上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%，CAS号为96574-01-5)，之后每2 d注射1次，对照组与模型组注射等剂量生理盐水。第28天各组白兔麻醉处死后在无菌条件下，切取L4～5小关节，分离关节软骨及滑膜组织进行指标检测。

1.3关节软骨组织学变化

常规固定、脱钙、包埋，矢状位切片，采用番红/固绿染色法观察腰椎小关节内软骨组织变化，中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱水，封片置于显微镜下观察。

1.4软骨组织内细胞凋亡情况

采用流式细胞术测定，配制胶原酶溶液，取小关节软骨放入至胶原酶溶液中，锡箔纸避光置于37 ℃ 震荡摇床上，转速300 r/min，40～60 min 可见组织几乎全部消化，离心(1 200 r/min，5 min)除去胶原酶，加入培养液，吹打混匀，筛网过滤，收集滤液，离心去上清，加入红细胞裂解液，冰上孵育，离心，去上清，加入RPMI 1640培养液，吹打混匀，离心，去上清液，加入不完全 RPMI 1640 培养液，得到软骨细胞悬液。AnnexinⅤ和7-AAD染色取 10 μL 血球计数板计数，加入1×Binding buffer 重悬，调整细胞密度为 1×106个/mL。取 100 μL 细胞悬液加入至 EP 管中，分别立即加入AnnexinⅤ和7-AAD进行染色，吹打混匀，室温避光孵育，再加入 200 μL 1×Binding buffer，调整待检测细胞浓度为1×106个/mL，流式细胞仪检测。

1.5滑膜组织炎症因子基因表达情况

qPCR 法检测 TNF-α、 IL-1β、IL-6 的 mRNA表达，收集各组滑膜组织，加入适量Trizol 裂解液，将样品置于冰上以 30%振幅超声，工作3 s后间歇暂停2 s，每个样品累积超声约30 s左右。随后陆续以氯仿、异丙醇、酒精等试剂对总 RNA 进行提取，并测定 RNA 的浓度；用RT试剂盒将RNA 反转录为cDNA，然后以cDNA 第1 链作为模板行PCR扩增。以QuantiTeckTM SYBR Green PCR试剂盒进行 qPCR 反应，qPCR 反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；72 ℃延伸 10 min。经 2^-ΔΔCT法进行数据分析。

1.6滑膜组织炎症因子蛋白表达情况

Western Blot法检测法检测 TNF-α、 IL-1β、IL-6 的蛋白表达，加入适量裂解液，样品置于冰上超声，离心后吸取上层总蛋白溶液。BCA法测定蛋白浓度，等量分装后上样缓冲液煮沸变性。SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，5%BSA封闭1 h，相应一抗孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育，TBST洗膜，ECL试剂检测蛋白表达，计算机图像分析仪测定灰度值。

1.7统计学方法

2 结果

2.1组织学观察

番红固绿染色观察到对照组软骨表面光滑，软骨层次清楚，细胞分布较均匀，软骨基质染色全层均匀深染。模型组经加压后软骨表面不平整，出现裂隙，基质染色不均，深层细胞排列紊乱。丹酚酸组软骨表面相对光滑，深层有少量簇聚的软骨细胞，番红O染色欠均匀(见图2)。

图2 番红固绿染色检测腰椎小关节软骨的变化(×100)

2.2流式细胞术检测软骨细胞凋亡

结果表明与对照组比较，模型组细胞发生了显著的凋亡，而丹酚酸组则明显下调了该模型中的凋亡比例，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3及表1。

图3 AnnexinⅤ/7-AAD双染流式细胞仪检测软骨细胞凋亡

表1 流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率

炎症因子基因表达情况发现，相比模型组，SAA干预后，腰椎小关节滑膜组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 腰椎小关节滑膜组织内炎症因子基因表达

2.4滑膜组织炎性因子Western Blot检测

炎症因子蛋白表达情况同样发现，经SAA干预后，腰椎小关节滑膜组织内炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

图4 Western Blot检测腰椎小关节滑膜组织内炎性因子蛋白表达

3 讨论

腰椎小关节由双侧相邻椎体对应关节突组成。关节软骨覆盖其关节表面厚约0.2 mm，关节囊、韧带等软组织包绕所形成的关节腔内含少量关节液。腰椎小关节属于典型的滑膜关节其退变与骨关节炎(Osteoarthritis，OA)的一般病理表现有相似之处，也以关节软骨的进行性退变、滑膜炎症和软骨及软骨下骨的结构改变为主要特征，可出现关节边缘与软骨下骨反应性增生[8]。然而，由于生物力学的负重形式不同，小关节又具有自身特点。

腰椎小关节与椎间盘一同形成的三关节复合体结构是腰椎运动节段的重要关节[9]，腰椎受到外伤或异常应力均可引起小关节的损伤和退行性改变。另一方面，椎间盘退变造成椎间高度逐渐降低，引起运动支点后移至小关节，导致共轭效应，使其所承受的应力明显增大[10]。目前多数研究认为应力引发小关节内的炎症反应是造成关节退变与产生LFJOA的重要发病基础[11-13]。因此，本研究采用一种应力退变模型研究小关节的软骨病理变化以及滑膜炎性因子表达。

有关LFJOA的动物模型多以小关节腔内注射生物制剂建立，如Yeh等[14]在SD大鼠小关节内注射胶原酶，Gong等[15]采用注射碘乙酸钠造模，Shuang等[16]的研究显示注射弗氏完全佐剂可使小关节内炎性因子显著上调，但注射尿激酶[17]会严重破坏软骨组织。采用关节腔注射生物制剂能够快速建立类似OA的小关节动物模型，但难以观察生物力学与运动力学对小关节的影响。作为三关节复合体结构的一部分，异常应力与LFJOA的发生有很大联系，因此相关应力模型对研究LFJOA有着重要作用。张继业等[18]应用小关节加载拉簧建立了高应力兔LFJOA模型。前期本团队设计了一种作用在兔脊柱运动节段上的在体加压装置，该装置设计有螺纹调节部件，可实现对脊柱运动节段轴向应力的个性化加载，并利用自锁特性，实现对加载负荷的稳定维持。前期笔者利用该模型初步观察了持续应力对脊柱运动节段的影响，通过比较显示加压28 d后可造成加压节段双侧腰椎小关节明显退变，本研究进一步利用该模型研究中医药对退变小关节的干预作用。

LFJOA所导致的下腰痛属于祖国医学“痹病”的范畴，目前临床治疗本病的方法以保守治疗为主，包括有口服非甾体抗炎药物、理疗、按摩和针灸等。但对退变小关节组织本身未能起到改善作用，新的生物学治疗目标是在抑制炎症反应的同时阻止或延缓关节退变，促进组织修复，重新建立关节的生物力学性能，从而彻底缓解腰痛等临床症状[3-4]。祖国医学治疗此类疾病具有丰富的经验，前期笔者临床研究中应用补肾活血方治疗下腰痛类相关疾病取得了较好疗效，可显著缓解患者的疼痛症状。通过离体实验证实本方中的活血药物“丹参”在本方延缓组织退变的过程中发挥了重要作用[19-20]。《明理论载》言：“一味丹参，功兼四物”，其具有祛瘀止痛、活血通经等功效，是中药学中应用较广、价值较高的药物之一[21-22]。随着对丹参化学成分及药理作用与临床研究的广泛深入，鉴定出丹参中包括脂溶性以及水溶性成分共约30余种[23]。笔者前期研究结果显示含有丹参水溶性成分的含药血清能够延缓腰椎运动节段组织退变[5]。

前期通过网络药理学分析显示，丹参中的主要水溶性入血成分丹酚酸A能够从多靶点治疗LFJOA(见图1)。SAA属酚酸类化合物，分子量及分子式分别为94.447和C26H22O10。由于SAA显著的抗氧化、抗缺血、抗纤维化等药理活性[24-27]，多年以来一直是医药研究的热点。最新研究证实SAA能够治疗骨关节炎[6]可通过下调NF-κB和p38/MAPK信号通路发挥对OA软骨细胞的抗炎作用[28]。据此，笔者通过本研究中的在体实验观察了SAA对LFJOA的干预作用。

结果表明经SAA干预后可显著提高小关节软骨细胞数量，能够缓解持续压力对软骨造成的损伤程度，并且可显著降低滑膜组织中的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6等的表达。这些结果提示丹酚酸A能够起到抑制小关节软骨细胞凋亡与滑膜炎症反应的协同干预作用，缓解LFJOA的发生发展。相关研究已发现丹酚酸A在体内多系统中有显著的抑制细胞凋亡与炎症作用，例如丹酚酸A可通过调节Bc1-2/Bax和Caspase-3信号通路抑制肝细胞凋亡[29]，还可以通过激活Nrf2/HO-1通路减少小肠隐窝上皮细胞凋亡数量[30]，在缺血心肌细胞中SAA通过调控P13K/Akt信号途径抑制炎症因子的生成[31]，而SAA抑制软骨细胞凋亡与滑膜炎症反应的机制需要进一步探索。

下一步将从基因表达、细胞信号传导通路以及蛋白修饰等方面深入探究丹酚酸A治疗LFJOA的作用机制，为进一步拓展丹参单体制剂的适应证与应用范围提供依据，并为其临床开发与应用奠定基础。