宋凯 潘乐 李智斌 王官林 孙晓洁 刘康 唐少雄 杨利学△

腰椎间盘突出症(Lumbar Disc Hernation，LDH)是引起中老年人腰痛的重要因素[1]，LDH主要由椎间盘的退变引起，且发现椎间盘细胞的活性变化和炎性变化对椎间盘的退变起重要作用[2]。研究表明益气活血补肾可以降低炎性因子在退变型髓核细胞中的表达，使得细胞外基质降解，加速退变型髓核的重吸收[3-4]。本实验采用右归丸为补肾方药代表，桃红四物汤为活血方药代表，研究各组含药血清干预肝肾亏虚型人退变髓核细胞后细胞活力及炎性因子表达的变化。并根据中医辨证论治理论验证右归丸含药血清干预肝肾亏虚型退变髓核细胞效果优于桃红含药血清组，从侧面进一步论证了辨证论治的科学性。

1 材料与方法

1.1病例资料

选择2019年6月至2019年12月就诊于陕西中医药大学附属医院脊柱骨科辨证分型为肝肾亏虚型的腰椎间盘突出症手术患者。经医院伦理委员会备案同意，患者签署知情同意书后，手术中获取相关废弃髓核组织作为实验材料。

1.2纳入标准

按照LDH的中西医诊断标准进行：1)经伦理委员会同意且患者自愿签署知情同意书；2)查体符合LDH[5]；3)经CT或MRI检查证实；4)中医辨证属肝肾亏虚型[6]；5)具备手术适应证，行椎间盘髓核摘除术；6)20～50岁。

1.3排除标准

1)不满足纳入标准的患者；2)存在心脑血管、肿瘤等其他严重疾患；3)存在结核、乙肝等传染性疾病的疾患；4)不愿意参与调查研究治疗流程的患者。

1.4标本来源

来源于陕西中医药大学附属医院骨科符合纳排标准的住院患者，共3例。手术中获取废弃髓核组织，将手术取得的新鲜髓核组织置于含有医用生理盐水的25 mL无菌离心管中，立即送往陕西中医药大学细胞实验室进行细胞分离及培养。

1.5试剂与仪器

胎牛血清(FBS)(西安博达技术有限公司)；青链双抗(西安博达技术有限公)司；BCA试剂盒(Thermo Scientific飞世尔科技公司)；WB配胶试剂盒(Bio-Rad公司)；兔抗人IL-1(ABCAM)；兔抗人TNF-α(ABCAM)。倒置相差显微镜(尼康中国有限公司)；CO2细胞培养箱(皓庄仪器有限公司)；电泳仪、电转仪、电泳槽、PVDF膜、曝光仪(Bio-Rad公司)。

1.6方法

1.6.1含药血清的制备 选取6～8周龄健康SD大鼠48只，雌雄各24只，按照随机分配原则分成空白对照组、桃红四物汤组、右归丸组，每组16只(雌性、雄性各8只)。右归丸组成：熟地24 g，山萸肉9 g，枸杞子9 g，当归9 g，菟丝子12 g，鹿角胶12 g，山药12 g，杜仲12 g，附子6 g，肉桂6 g。桃红四物汤组成：当归15 g，熟地15 g，川芎15 g，白芍15 g，桃仁10 g，红花10 g。药物加水400 mL，浸泡0.5 h，水煎30 min，水煎至100 mL。根据动物与人体的每千克体质量折算系数表[7]计算各组大鼠灌胃药量，所得右归丸组大鼠每次灌胃量约为5.72 g/kg(250 g SD大鼠每次灌胃量约1.43 mL)，桃红四物汤组大鼠每次灌胃量约4.17 g/kg(250 g SD大鼠每次灌胃量约1.26 mL)。每天9点、16点灌药，连续5 d，最后一次灌胃1 h后腹主动脉采血。血样装入离心管，以 3 000 r/min 离心15 min，吸取上层液体，放在56 ℃恒温水浴锅中灭活30 min。随后进行过滤、灭菌，最后置于-20 ℃下冷冻备用，每次根据要求配制相应浓度。

1.6.2退变髓核细胞的培养 剪取髓核组织，采用0.25%胰蛋白酶消化，加入20% FBS、1%双抗终止消化，离心后接种至25 mL细胞培养瓶内，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，期间用倒置显微镜观察细胞生长情况，并拍照记录。待细胞生长接近90%时进行传代。

1.6.3MTT法测定细胞生长曲线 胰酶消化后接种细胞于96孔板，按分组进行不同浓度培养，待细胞贴壁后加入含药血清，分别于6、12、24、48、72 h进行MTT实验，选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(OD)，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6.4Western Blot检测各时间点IL-1、TNF-α表达的变化 实验分组：空白血清组、桃红血清组、右归血清组。不同含药血清梯度浓度干预培养后，分别在第3、7、14天收集细胞，进行Western Blot检测，主要步骤包括：1)提取细胞蛋白，取出细胞，吸弃培养液，用PBS洗一遍，按比例加入RIPA裂解液和PMSF，用移液枪吹打数次。约2 min充分裂解后，吸至离心管，12 000g，4 ℃离心10 min，取上清，用BCA法测蛋白浓度，并将上清制备成样品储备液。2)取适量的样品加入上样孔内，进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗，每次孵抗体结束后，都用TBST(1X)洗膜3次，每次10 min。最后将洗后的PVDF膜用ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带。用Image J软件测定蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量，每组重复6次，进行统计分析。

1.7统计学方法

2 结果

2.1髓核细胞在不同时间点的生长变化

经胰酶消化法培养后，髓核细胞在不同时间点的生长变化见图1。

(a)～(d) 分别为第1、3、7、14天原代髓核细胞；(f) 二代髓核细胞图1 髓核细胞在不同时间点的生长变化

2.2不同浓度含药血清干预下细胞生长曲线

从图2-图4可以看出，10%空白血清、20%桃红四物汤含药血清及20%右归丸含药血清更有利于髓核细胞生长，且含有药物血清的两组细胞生长活力更强。

图2 空白对照组大鼠含药血清干预后OD值

图3 桃红四物汤组大鼠含药血清干预后OD值

图4 右归丸组大鼠含药血清干预后OD值

2.3各时间点IL-1、TNF-α表达的变化

Western Blot检测各时间点IL-1、TNF-α表达的变化，见图5-图7及表1-表2。

图5 第3天各组IL-1和TNF-α的表达水平

图6 第7天各组IL-1和TNF-α的表达水平

图7 第14天各组IL-1和TNF-α的表达水平

从表1-表2可以看出：3组细胞经3、7、14 d培养后，与空白血清组相比，桃红血清组及右归血清组IL-1和TNF-α均有下降，经F检验，差异有统计学意义(P<0.05)；右归血清组较桃红血清组下降更加明显，经F检验，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组分别在第3、7、14天的TNF-α表达水平

表2 各组分别在第3、7、14天 的IL-1表达水平

3 讨论

据腰椎间盘突出症的典型临床症状表现，属中医学中的“腰痛”“痿证”范畴[8]。《素问·脉要精微论》云“腰者，肾之府，转摇不能，肾将惫矣”。《丹溪心法》云“瘀血而致腰痛者，称沥血腰痛，与跌仆闪挫，或碰撞所伤，或腰痛经久，瘀血凝积而成”。腰痛病主要病机为本虚标实，本虚以肾虚为关键，标实为瘀血、痰饮等，主要表现为“不通则通、不荣则痛”，引起腰骶部的疼痛不适等症状。右归丸[9]以温补肾阳、填精益髓为功用，主治肾阳不足，命门火衰证。桃红四物汤主要功用为养血活血，主治血虚血瘀证。研究表明[10]补肾活血中药可促进椎间盘髓核细胞增长，抑制髓核细胞炎症反应，减少炎症因子的合成，缓解髓核细胞的凋亡，并且认为“肝主筋、肾主骨”与LDH的发生具有密切联系。

本实验研究表明，右归丸及桃红四物汤大鼠含药血清可以促进体外髓核细胞的生长，并且可以降低IL-1、TNF-α表达，且右归丸含药血清在降低同证型患者髓核细胞炎性因子表达方面，效果更为显著。相关研究表明[11]促进髓核细胞的生长与控制炎症因子的表达对于延缓椎间盘的退变有重要的意义。研究显示椎间盘的内源性稳定遭到破坏，椎间盘内的炎症因子水平增加，炎症因子的介入可导致蛋白多糖和胶原的降解，并影响多糖和胶原的分泌及生成，最终加快腰椎退变的速度[12]。炎症因子主要有IL-1、IL-6、IL-2、IL-4、TNF-α、前列腺素2(PGE)、IFNγ、趋化因子等，但目前研究较多的为IL-1和TNF-α。IL-1和TNF-α可使基质金属蛋白(metal matrix proteinase，MMPs)的表达上升，该类蛋白降低多糖和Ⅱ型胶原的生成，并促进Ⅰ型胶原的生成，Ⅰ型胶原可促使椎间盘细胞的纤维化，最终出现软骨细胞变性、坏死[13]。炎症因子可导致并加速椎间盘的退变，腰椎间盘的退变也会诱导炎症因子的水平，二者相互影响。陈江等[14]通过益肾通络活血方干预椎间盘细胞，通过NF-κB信号通路促进Caspase-3和CollagenⅡ的表达，抑制MMP-13、NF-κB、p65、ADAMTS-4来增加细胞活性，减少髓核细胞的凋亡，缓解髓核细胞的退变。Hong等[15]发现肉桂水提取物对小鼠血清进行干预可抑制 IL-6和TNF-α水平的表达，降低血清中的炎症因子，可缓解炎症反应。右归丸及桃红四物汤在临床中可以有效的治疗腰椎间盘突出症，可能与增加髓核细胞生长及降低炎性反应有关。

综上所述，本实验通过体外研究证实右归丸含药血清和桃红四物汤含药血清都有利于退变髓核细胞的生长，并可降低炎症因子IL-1、TNF-α的表达，且针对肝肾亏虚型退变髓核细胞，右归丸的作用更为显著，这将为临床使用右归丸治疗肝肾亏虚型LDH提供理论依据。同时从侧面反映了同证型方药对该证型退变髓核细胞干预效果较优，进而体现了中医辨证论治的科学性。