雷嗣超，张家音，赵泓涛，李浩楠，杨 芳

（武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205）

板栗是我国传统的农副产品，具有很高的营养价值和药用价值。截至2017 年，我国板栗总种植面积达180万hm2，年产量200 万t，占世界板栗总产量的84%[1]。目前，板栗加工以果肉为主，其他加工副产物往往被浪费，未得到充分利用[2]。研究表明，板栗的花、树叶、皮和果实提取物中均含有大量的多酚类物质，而板栗皮中多酚含量最多。板栗皮包括板栗内皮（也称为板栗囊衣）和板栗外皮（也称为板栗壳）。在板栗皮中的多酚物质中，儿茶素类物质属于类黄酮化合物中的黄烷-3-醇类[3]，具有酚类化合物的共同特性，如抗菌[4]、抗氧化[5]、抗动脉硬化[6]、抗血栓形成[7]以及抗肿瘤等作用[8]。因此，儿茶素类化合物被广泛应用于功能性食品开发[9]、食品保鲜[10-12]以及食品护色等领域。研究表明，儿茶素类物质因其结构特点，易受外界环境的影响而使其生物利用率降低[13]，影响其在食品行业的应用[14]。

目前对板栗皮多酚物质的研究主要集中在提取工艺优化、抗氧化性以及抑菌活性等方面，但是，对于板栗皮儿茶素类物质的研究较少，而关于其在人体胃肠消化道内消化情况的研究则更为少见。因此，本试验采用基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的广泛靶向代谢组学研究板栗皮儿茶素类物质在口腔、胃肠道模拟消化体系中的组成变化，为板栗皮儿茶素类物质在功能性食品开发方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗，产自山东省沂蒙山。

乙醇、甲醇、乙腈、乙酸，德国墨客公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆汁提取物，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

THZ-100 恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司；FW80 型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10 普通实验型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；MM 400 研磨仪，Retsch 公司；超高效Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC），岛津公司；Applied Biosystems 6500 Q TRAP 串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS），岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 试验处理

将板栗皮样品分为4 组进行代谢研究，每组样品进行3 次生物学重复实验，4 组样品分别为“消化前的板栗外皮提取物（chestnut shell extract，CSE）”、“消化前的板栗内皮提取物（chestnut pellicle extract，CPE）”、“消化后的板栗外皮提取物（digested chestnut shell extract，DCSE）”、“消化后的板栗内皮提取物（digestedchestnut pellicle extract，DCPE）”。

1.3.2 板栗皮粗提物的制备

将板栗皮除杂后用水清洗，采用自然干燥（室温）和干燥箱干燥（45～50 ℃）结合的方式将板栗皮中的水分烘干。干燥后，用粉碎机将板栗皮进行多次粉碎，过40 目筛，以分离板栗内皮与板栗外皮。分别称取一定量粉碎后的板栗内皮和外皮，参考苏云霞等[15]方法进行提取，料液比为1∶15（板栗壳粉末∶70%的乙醇溶液，g/mL），乙醇水溶液体积分数为70%，恒温培养摇床温度55 ℃，振荡时间90 min，冷却后对溶液进行真空抽滤，再将滤液进行旋转蒸发，除去其中的乙醇和部分水，而后对剩余溶液进行冷冻干燥，低温保存备用。

1.3.3 体外模拟消化系统的构建

（1）体外模拟口腔消化

在50 mL 锥形瓶中依次加入板栗皮粗提物0.2 g、α-淀粉酶0.4 mL 和9 mg/mL 氯化钠溶液3.6 mL，将锥形瓶放入摇床中（250 r/min、37 ℃）震荡反应3 min[16]。

（2）体外模拟胃消化

人工胃消化液配制：将0.4 g 胃蛋白酶溶于90 mL、9 mg/mL 的NaCl 溶液中，用1 mol/L 的HCl 溶液调节pH至2～2.3[17]。

模拟胃消化试验：向上述经过模拟口腔消化的消化液样品中加入16 mL 胃消化液，在37 ℃水浴中震荡（250 r/min）2 h 后，滴加1 mol/L NaOH 溶液至pH 为7，终止模拟胃消化反应。

（3）体外模拟小肠消化

人工肠消化液配制：取225 mg 胰蛋白酶和225 mg胆汁提取物溶于90mL、9mg/mL 的NaCl 溶液中，用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 至7～7.2[18]。

模拟肠消化试验：向上述经过模拟胃消化的消化液样品中加入20 mL 肠道消化液，反应2 h 后，得到样品肠消化液。

1.3.4 板栗皮样品前处理

将胃消化和肠消化后的板栗内皮及外皮粗提物样品分别进行真空冷冻干燥，而后加入研磨仪（30 Hz）中研磨1.5 min，称取100 mg 样品粉末，溶解于1.0 mL、70%的甲醇水溶液中，将溶解后的样品放在4 ℃冰箱中过夜，并在放置过程中涡旋3 次，提高提取率。离心10min（10000g离心力下），吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm 孔径）过滤样品，将过滤后的样品保存在进样瓶中，用于LC-MS/MS 分析。

1.3.5 液相色谱仪分析条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流动相：A 为0.04%乙酸水溶液，B 相为乙腈（含0.04%的乙酸）。流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。

洗脱梯度：洗脱剂由（A）含有0.04%乙酸的水和(B)含有0.04%乙酸的乙腈组成，洗脱程序设置为二元梯度，具体如下：0～11.0 min，5%（A）；11.0～12.0 min，5%（A）；12.0～12.1 min，从5%～95%（A）；12.1～15.0 min，95%（A）。流速设定为0.40 mL/min。流出物交替连接到电喷雾三重四极杆线性离子阱质谱。

1.3.6 质谱分析条件

质谱参数如下：电喷雾离子源温度为500 ℃，喷雾电压为5 500 V，离子源帘气为25 psi。仪器调优和质量校准分别在QQQ 和LIT 模式下在10 μmol/L 和100 μmol/L聚丙二醇溶液中进行。实验使用的碰撞气体（氮气）设置为5 psi，进行多个反应监测（MRM）实验得到QQQ 扫描。

1.4 数据统计与分析

样品进入超高效液相色谱和串联质谱得到一系列代谢物质谱分析数据，通过软件Analyst 1.6.3 进行数据处理，根据代谢物保留时间与峰型的信息，对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。校正后数据显示若合格，则采用Statistix 9 统计软件对实验数据进行方差分析和Duncan 多重比较分析，并采用SIMCA 软件进行无监督模式识别的主成分分析（principal component analysis，PCA），而后对代谢物含量数据进行Zsore 值归一化处理，通过Tbtools 软件绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 样本质控分析

质控样本（QC）由样本提取物混合制备而成，通过对不同质控QC 样本质谱检测分析的总离子流图（TIC 图）进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性。QC 样本质谱检测总离子流图见图1。

图1 QC 样本质谱检测总离子流图（TIC 图）的叠加图Fig.1 Overlay diagram of TIC diagram detected by mass spectrometry of QC sample

由图1 可以看出，代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好。

2.2 方差分析及主成分分析

2.2.1 板栗外皮消化前后儿茶素类物质含量的变化

对图1 的数据结果进行筛选，得到表1 数据结果，利用SIMCA 软件对8 种儿茶素类物质消化前后的数据结果进行无监督模式的主成分分析（PCA），得到板栗外皮消化前后儿茶素类物质的PCA 得分图（图2）和板栗内皮消化前后儿茶素类物质的PCA 得分图（图3）。并对数据结果进行方差分析、Duncan 多重比较分析，结果如表2 和表3 所示。

表1 8 种儿茶素类物质消化前后的数据结果Table 1 Data results of 8 catechins before and after digestion

表2 板栗外皮消化前后儿茶素类物质的含量变化Table 2 Changes of catechins content in chestnut skin before and after digestion

图2 板栗外皮消化前后儿茶素类物质的PCA 得分图Fig.2 PCA scores of catechins in CSE before and after digestion

图3 板栗内皮消化前后儿茶素类物质的PCA 得分图Fig.3 PCA scores of catechins in CPE before and after digestion

由图2 得出，消化前后板栗外皮儿茶素类物质的数据点在得分图上有显著区别，消化前板栗外皮儿茶素类物质的数据点位于第一、四象限内，消化后板栗外皮儿茶素类物质的数据点位于第二、三象限内。总体来说，消化前后板栗外皮样品中的儿茶素类物质含量存在显著差异。

表2 结果显示，在经过模拟消化体系后，板栗外皮中的儿茶素类物质含量较消化前含量均有显著降低（P＜0.05），可能是因为儿茶素类物质的结构易受影响性，在经过模拟体系时，pH 的变化和消化酶的存在使得儿茶素类物质降解，导致其含量降低。

2.2.2 板栗内皮消化前后儿茶素类物质含量的变化

从图3 可以看出，消化前后板栗内皮儿茶素类物质的数据点在得分图上也有显著区别，消化前板栗内皮儿茶素类物质的数据点位于第一、四象限内，消化后板栗内皮儿茶素类物质的数据点位于第二、三象限内，表明消化前后板栗内皮样品中的儿茶素类物质含量同样存在显著差异。

表3 结果显示，在经过模拟消化体系后，板栗内皮中的儿茶素类物质含量均比消化前的含量显著降低（P＜0.05），与板栗外皮儿茶素类物质消化前后所发生的变化一致，原因也大体一致。

表3 板栗内皮消化前后儿茶素类物质的含量变化Table 3 Changes of catechins content in chestnut before and after endothelial digestion

2.3 代谢前后差异组分聚类分析

为进一步解析代谢物变化规律，对数据进行Zsore值归一化处理后，对所有样品进行聚类热图分析，并通过Tbtools 软件绘制聚类热图（图4 和图5）。图中横坐标表示样品名称，纵坐标表示代谢物名称，颜色代表相关系数值大小，红色越深代表含量越高，蓝色越深代表含量越低。

图4 板栗外皮儿茶素类物质消化前后显著差异代谢物Fig.4 Significant difference of metabolites of catechins in CSE before and after digestion

图5 板栗内皮儿茶素类物质消化前后显著差异代谢物Fig.5 Significant difference of metabolites of catechins in CPE before and after digestion

图4 结果显示，在对数据进行归一化处理后，板栗外皮消化前儿茶素类物质含量均较高，且相互之间含量的差距不明显，均显示为红色并规则地进行聚集，消化后则均显示为蓝色。由此可得，板栗外皮消化前儿茶素类物质含量（CSE）显著高于经过模拟消化体系后的儿茶素类物质含量（DCSE）。

图5 结果显示，板栗内皮地聚类情况与板栗外皮相似，即所得结果一致，可见消化前的板栗内皮（CPE）儿茶素类物质含量显著高于经过模拟消化体系后样品（DCPE）的儿茶素类物质含量。

2.4 代谢差异物分析

2.4.1 板栗外皮消化前后儿茶素类物质中的代谢差异物

板栗外皮消化前后的儿茶素类物质中的显著代谢差异物见表4，由表4 可得，板栗外皮消化前后的儿茶素类物质含量均存在显著降低，其中没食子儿茶素降低程度最高，达94.96%。表没食子酸儿茶素和表儿茶素次之，分别达89.70%和87.77%。没食子酸儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、儿茶素分别为78.98%、77.88%、63.94%、60.58%、55.08%。

表4 板栗外皮消化前后儿茶素类物质中的显著代谢差异物Table 4 Significant metabolic differences of catechins in CSE before and after digestion

2.4.2 板栗内皮消化前后儿茶素类物质中的代谢差异物

板栗内皮消化前后儿茶素类物质中的显著代谢差异物分析见表5，由表5 可得，板栗内皮消化前后的儿茶素类物质含量均存在显著降低，其中没食子儿茶素降低程度最高，达95.20%。表没食子酸儿茶素和表儿茶素次之，分别达90.71%和90.61%。没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯及儿茶素分别为78.42%、78.08%、78.05%、75.97%及65.81%。

表5 板栗内皮消化前后儿茶素类物质中的显著代谢差异物Table 5 Significant metabolic differences of catechins in CPE before and after digestion

3 结论

本试验采用体外消化模拟体系，通过超高效液相色谱和串联质谱得到一系列代谢物质谱分析数据，而后通过方差分析、Duncan 多重比较分析、无监督模式识别的PCA 分析及聚类分析等方法对板栗内皮和外皮提取物中儿茶素类物质消化前后的组成进行分析。试验结果显示，经过模拟消化体系后板栗皮中的8 种儿茶素类物质含量均比消化前显著降低，原因可能与pH 的变化和消化酶的存在有关。未来，可进一步研究儿茶素类物质在体内的稳定性，采用负载等包埋方法将其靶向输送到吸收部位，以提高其生物利用率，为将其开发为功能性食品提供参考依据。