侯巧利，王庚申，谢建军，施 慧，许文军

（1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei是我国四大养殖虾类之首，2019 年该品种养殖产量达181.5 万t，占我国虾类养殖总产量的39%以上[1]。“早期死亡综合征”（early mortality syndrome,EMS）是近年来在东南亚和墨西哥等地凡纳滨对虾养殖场中爆发的一种新疾病，给对虾养殖业造成重大经济损失[2-3]。2009 年开始，该病在我国南方的凡纳滨对虾养殖场爆发流行，病虾嗜睡，出现空肠空胃，肝胰腺颜色发白，部分患病虾的肝胰腺呈萎缩或肿大等症状,该疫病病程短，短时间内死亡率可达80%以上[4-5]。2012 年8 月，亚太水产养殖中心网络（NACA）根据该疫病导致的对虾肝胰腺组织病理学特征，正式命名该疫病为急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）[6]。李俊德等[7]研究发现导致对虾爆发AHPND 的高致病性副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus都携带一个70 kb 大小的pVA1 样质粒，该质粒上的2 个基因pirAvp和pirBvp编码了2 种毒力蛋白，自然缺乏pir基因或人为敲除pir基因，菌株会明显失去致病力，证明了毒素蛋白PirAvp和PirBvp是引起对虾AHPND 的关键。最新研究表明，除了副溶血性弧菌携带该毒力基因，在其他致病性弧菌中也发现了含pir毒素基因的pVA1 样质粒，特别是哈维氏弧菌V.harveyi、欧文斯氏弧菌V.owensii和坎贝氏弧菌V.campbellii等[8-10]。

自2014 年开始，舟山多家凡纳滨对虾养殖场苗种在投放后25 d 左右出现规模性的急性死亡现象。病虾主要表现为虾壳变软，体表色素点异常增多，肝胰腺发白萎缩，与已报道的AHPND 临床病症相似。2014-2019 年期间，本实验室从舟山地区临床发病对虾肝胰腺中共分离到30 株病原菌，为了探讨引起舟山对虾养殖中引发疑似AHPND 的病原菌流行病学，本研究通过16S rRNA 基因及gyrB、rpoA等基因同源性检索分析对30 株分离菌进行了鉴定；用Nested-PCR 方法从30 株临床分离株鉴定出10 株pirABVP阳性菌株，选取5 株代表性菌株，分别进行了毒力基因pirAvp和pirBvp的PCR 扩增分析，同时通过浸泡感染方式，对5 株细菌的致病性开展了初步研究，以期为舟山凡纳滨对虾养殖中病害诊断提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用细菌与对虾

本研究中共使用30 株细菌，为2014-2019 年期间从浙江舟山地区养殖场疑似患AHPND 的凡纳滨对虾肝胰腺组织中分离获得。

人工感染试验所用凡纳滨对虾，购自浙江舟山登步某对虾养殖场，体长约2～4 cm，体重约为（0.88±0.2）g，水温25～27 ℃，早晚各投喂1 次配合饲料，经pirABVP毒力基因PCR 检测为阴性后，暂养1～3 d 备用。

1.1.2 试剂

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购于青岛高科园海博生物技术有限公司，TCBS 琼脂购于杭州滨和微生物试剂有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 购自TaKaRa 公司，实验所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA 模板的制备与pirABVP基因PCR 扩增

将实验室甘油保存试验菌株在TSA 平板上划线，28 ℃恒温培养18～24 h，观察菌株形态以及荧光产生情况。挑取TSA 平板上菌落形态、大小一致的单菌落，使用DNA 抽提试剂盒（Qiagen 公司），按说明书提取30 株细菌的总DNA，作为PCR 扩增的模板。

pirABvp基因PCR 检测，采用《世界动物卫生组织（OIE）水生动物疾病诊断手册》第2.2.1 章4.3.1.2.3.1.10（AP4 套式PCR 法）进行AHPND 相关毒力基因pirABvp的PCR 扩增[11]。PCR 扩增反应体系（25 μL）：17.25 μL超纯水，2.5 μL 的10×Reaction buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），2.5 μL 模板DNA，上下游引物（10 pmol·L-1）各0.25 μL，0.25 μL Taq 酶。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。

1.2.2 细菌鉴定与筛选

参考文献[12]设计合成细菌16S rRNA、gyrB 和ropA 基因的通用引物（表1），PCR 扩增方法按照张晓君等[13]及徐加涛等[14]方法进行，PCR 产物经1.5%凝胶电泳检测后，送往上海生物工程公司进行基因序列测定。运用DNAMAN 7.0 软件对测序获得的16S rRNA、gyrB 和ropA 基因序列进行比对分析，确定分离菌株的细菌种类，从pirABVP阳性菌株中筛选出代表性菌株进行后续病原菌致病性分析试验。

表1 相关功能基因引物序列Tab.1 Primer sequence of related functional genes

1.2.3 菌株特定基因的PCR 扩增

以1.2.1 中提取的DNA 作为PCR 模板，对选取的细菌进行副溶血弧菌相关毒力基因的PCR 检测，包括分子伴侣蛋白基因groEL、耐热直接溶血毒素基因tdh、相对耐热溶血毒素基因trh 和不耐热溶血毒素基因tlh，同时对pirAVP和pirBVP基因序列进行PCR 扩增及序列测定，引物见表2，PCR 反应体系同1.2.1。

表2 副溶血弧菌相关毒力基因检测引物Tab.2 Primers for virulence detection of VP-AHPND specific genes

1.2.4 人工感染试验及组织病理分析

采用不同的浸泡感染方法对健康对虾进行回感试验。试验菌分别在TSA 培养基上进行增菌培养，28 ℃恒温培养18～24 h，1.5%的无菌生理盐水洗脱菌苔，重悬于1.5%的无菌生理盐水中，分光光度计测定菌液在OD 550 nm 下的吸光度值，确定细菌含量。同时取适量菌液涂布TSA 培养基，28 ℃恒温培养24 h 后计数。

感染试验分别设置试验A 组、试验B 组及空白对照组，各试验组设置3 个平行，每组20 尾虾。将60尾健康对虾在1 L 含2×108CFU·mL-1细菌的海水中浸泡，15 min 后将浸泡后的对虾转移到含10 L 养殖水体的试验缸中；在试验A 组的养殖水体中加入预先制备的菌液，使菌含量最终为2×106CFU·mL-1；试验B 组的养殖水体不加菌；对照组采用10 L 海水浸泡，15 min 后转移到同样体积的养殖水体中。各试验组在浸泡期间保持充氧，水温保持恒定为（26±2）℃，各组早晚各投喂1 次，试验连续观察7 d，计算各组累计死亡率。

取濒死对虾的肝胰腺和肠道组织固定于Bouin 氏液中，在24 h 后换数次75%乙醇冲洗，最后保存于75%的乙醇中。固定样品经乙醇系列及丙酮脱水过程，移入二甲苯溶液中透明，浸蜡包埋后切片，烤干后展片以苏木精-伊红染色法（H&E）染色，显微镜下观察拍照[15-17]。

2 结果

2.1 细菌pirABvp 基因PCR 检测结果

30 株菌在TSA 和TCBS 培养基上都生长良好，其中7 株菌在暗视野下可以观察到显著的荧光（图1）。为了确认30 株临床分离菌是否携带pirABvp基因，采用OIE《水生动物疫病诊断手册》的Nested-PCR 法对细菌株进行了预筛选。结果显示：30 株细菌中共有10 株菌携带pirABvp基因，占比为30%（图2、图3）。

图1 部分菌株黑暗处可观察到荧光Fig.1 Fluorescence can be observed in darkness of some strains

图2 AHPND 一次PCR 检测图Fig.2 Electropherograms of the first round PCR product

图3 AHPND 二次PCR 检测图Fig.3 Electropherograms of the second round PCR product

2.2 16S rRNA 基因鉴定及细菌筛选

经16S rRNA 及gyrB、rpoA 等基因分析比对结果显示，30 株试验菌株中有副溶血弧菌7 株，坎贝氏弧菌8 株，欧文斯氏弧菌7 株；而10 株pirABVP阳性菌株中，有4 株为副溶血弧菌、2 株为欧文斯氏弧菌和5株为坎贝氏弧菌（表3）。从10 株pirABVP阳性菌中筛选出4 株代表性菌株用于后续感染实验，分别为1 株副溶血弧菌（1406001）、1 株欧文斯氏弧菌（1906001）和2 株坎贝氏弧菌（1509001、1904001），以及1 株坎贝氏弧菌pirAB—（1508001），其中2 株坎贝氏弧菌在暗视野下可以观察到显著的荧光。菌株1406001 基因序列与GenBank 中已发布的致AHPND 的高致病性副溶血弧菌（GQ205448）的序列具有99.93%的相似度性；菌株1508001、1509001、1904001 序列与坎贝氏弧菌序列（MT207282）相似度为99.35%；菌株1906001 基因序列与欧文斯氏弧菌序列相似度99.65%。

表3 11 株菌16S rRNA、gyrB、rpoA 序列在GenBank 中同源性最高的基因序列Tab.3 The 16S rRNA, gyrB,rpoA sequence of 11 strains showed the highest homology in GenBank

2.3 细菌特定基因的检测结果

本实验中对副溶血弧菌毒力分子标记基因tdh、trh 和tlh 及副溶血弧菌特异性标志基因groEL进行检测，30 菌株毒力基因检测结果显示，7 株副溶血弧菌均携带groEL 基因分子蛋白，且含有tlh基因，不携带副溶血弧菌临床毒力基因tdh和trh；其中包括菌株1406001，其它4 株菌对tdh、trh、tlh以及groEL基因PCR扩增结果均为阴性（表4）。

表4 菌株毒力基因鉴定Tab.4 Virulence gene results of bacterial strain

运用BLAST 软件对副溶血弧菌（1406001）、坎贝氏弧菌（1509001、1904001）和欧文斯氏弧菌（1906001）的pirAVP和pirBVP样基因的PCR 产物进行序列分析。结果表明，4 株pirABVP阳性菌的pirAVP和pirBVP基因序列之间的同源性为100%，与已报道的副溶血性弧菌质粒的pirAvp和pirBvp样基因序列（登录号为MH718270）相比对分析，覆盖率100%，相似度为100%。根据Nested-PCR 检测结果以及菌株的pirAVP和pirBVP基因的测序分析结果显示，该4 株菌被初步确定为可以导致AHPND 的致病菌。

2.4 人工感染实验结果

参考TRAN,et al[18]的试验方法，对健康凡纳滨对虾开展人工感染试验，测定不同菌株的致病性，整个感染试验周期7 d。实验期间，对照组对虾和不携带pirAVP和pirBVP基因的菌株1508001 感染组对虾肝胰腺正常，对虾摄食和活力正常，未出现死亡；试验过程中，持续细菌暴露组（试验A 组）对虾感染后发病较快，感染12 h 后对虾活力明显下降，并出现发病死亡的个体，24～72 h 内死亡对虾数量急剧增加，最高达85%；试验B 组对虾，在感染18 h 后开始出现零星死亡，24～72 h 内对虾死亡数量缓慢增加，死亡率最高为55%。试验A 组中，菌株1406001 感染对虾后，对虾发病最快，在感染72 h 内死亡率急剧升高，96 h 内实验组对虾死亡率高达90%；菌株1904001 感染对虾后，对虾发病比较缓慢，在72 h 内死亡率只有50%，见图4；试验结果表明4 株菌的毒力有一定差异，环境中高浓度致病菌增加了对虾死亡率。在感染7 d 后，所有存活的对虾基本都出现对虾体表色斑点异常增多，部分对虾甲壳及须发红明显，空肠空胃，腹节肌肉透明度下降，肝胰腺颜色变为淡黄色甚至发白等症状（图5）。

图4 实验各组的累积死亡率（平均值±标准差）Fig.4 The cumulative mortality of stains in different treatments（mean±SD）

图5 感染组与空白组凡纳滨对虾Fig.5 The shrimp infected by the isolated strain and normal L.vannamei

2.5 组织病理学观察

浸浴感染试验过程中，取样濒死对虾肝胰腺经石蜡切片和HE 染色制片，进行光镜下进行组织病理学观察。结果显示：对照组对虾的肝胰腺组织管腔结构完整，可以清晰分辨出吸收细胞、分泌细胞及纤维细胞[19]（图版I-1）。与对照组相比，携带pirABVP的质粒的菌株1406001、1509001、1904001、1906001 感染组对虾的肝胰腺组织发生严重的病理学变化，肝胰腺组织中的管状结构出现严重崩塌，部分功能细胞缺失，血淋巴细胞增多（图版I-2）；部分肝胰腺小管上皮层变薄，上皮细胞脱落至管腔内（图版I-3），无法分辨出B细胞、R 细胞和F 细胞，小管中可见大量细菌，且出现大量血淋巴细胞浸润的现象（图版I-4）；细胞核也出现肿大（图版I-5），呈现典型的AHPND 病理学特征。

图版Ⅰ 凡纳滨对虾的肝胰腺HE 染色组织切片观察Plate Ⅰ HE-stained histological sections of the hepatopancreas of L.vannamei

肠道组织切片结果显示，正常对虾肠道上皮细胞排列紧密，上皮细胞与基膜紧密相连，细胞间隙清晰，肠道内壁向肠腔内形成褶皱[20]（如图版II-1）。菌株感染后，凡纳滨对虾肠道组织形态出现明显变化，细胞游离端绒毛脱落，上皮细胞出现细胞核肥大（图版II-2）；基膜与上皮细胞出现间隙，肠道损伤严重则会出现上皮细胞脱落（图版II-3）；细胞核边缘模糊不清等症状（图版II-4）。

图版Ⅱ 凡纳滨对虾肠道组织切片Plate Ⅱ Histological examination of L.vannamei midguts

3 讨论

本文对舟山地区2014 年至2019 年期间，疑似发生AHPND 凡纳滨对虾的肝胰腺中分离到的病原菌进行了细菌鉴定。根据16S rRNA、gyrB 及rpoA 等基因序列比对分析结果显示舟山地区患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离到的病原菌主要以副溶血弧菌、坎贝氏弧菌及欧文斯氏弧菌为主，其中有10 株菌携带pirABVP毒力基因的菌株，占总比的30%。选取4 株pirABVP阳性菌株进行回归感染试验，结果携带pirABVP毒力基因的副溶血弧菌、欧文斯氏弧菌和坎贝氏弧菌三株试验菌均可导致健康对虾发病死亡，且表现的临床症状和组织病理变化与报道的AHPND 相似；但不携带pirABVP基因的菌株则对健康对虾没有致病性。LIU Liyuan,et al[9]对欧文斯氏弧菌继代培养研究发现pirAB 基因具有不稳定性，在纯培养条件下pirAB 基因往往会丢失，本试验结果显示从疑似患AHPND 凡纳滨对虾肝胰腺上分离到的部分病原性弧菌并不携带pirABVP毒力基因，是否存在pirAB 基因丢失还有待进一步研究。携带pVA1 型质粒的高致病性副溶血弧菌最初被认为是对虾AHPND 唯一致病菌，但后续研究发现不同物种间pVA1 型质粒发生水平转移，哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌及欧文斯氏弧菌等弧菌也可携带pVA1 型质粒，并引起对虾发病。本试验结果显示，高致病性副溶血弧菌以及携带pirAB 毒力基因的欧文斯氏弧菌和坎贝氏弧菌是舟山地区养殖凡纳滨对虾爆发AHPND 的主要致病菌。

现有的文献报道显示16S rRNA 基因和hsp60、gapA、gyrB、recA、rpoA 等管家基因的PCR 扩增分析是弧菌种类鉴定和系统发育研究分析的主要工具。本文采用16S rRNA 基因，rpoA、gyrB、groEL 等管家基因和tdh、trh、tlh 等毒力基因相结合对弧菌进行了鉴定分类。tdh、trh 和tlh 是致病性副溶血弧菌的重要毒力因子，但TANIGUCHI,et al[21]研究发现副溶血弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都携带tlh 毒力基因。刘杰等[22]对67 株虾源副溶血弧菌进行tdh、trh 和tlh 毒力基因检测，结果所有菌株均为tdh～-trh～-tlh～+。本次试验中共检出7 株副溶血弧菌，毒力基因PCR 检测结果显示，7 株副溶血弧菌均携带毒力基因tlh，但不携带trh 和tdh 基因。本次实验中选取了1 株副溶血弧菌进行感染试验，该菌株不携带tdh 和trh毒力基因，但tlh 毒力基因PCR 检测为阳性；而其它3 株pirABVP阳性非副溶血弧菌试验菌株经PCR 检测均不携带这3 种毒力基因。感染实验结果显示，4 株pVA1 阳性菌株对健康对虾都有致病性，但是携带tlh基因的副溶血弧菌感染组对虾发病最快，临床症状最明显，死亡率最高。本次实验中tlh 毒力基因的存在是否加剧了菌株的致病性还有待进一步研究。

AHPND 是一种严重危害对虾养殖业健康发展的疫病，也是近年来全球对虾大规模减产的重要细菌性疾病之一[23-25]。对AHPND 最初的研究认为携带pVA1 致病质粒的副溶血弧菌是该病的致病菌[26]，但近年来，更多的研究报道证实其它携带pVA1 的弧菌也可以引起对虾AHPND 的发生。DONG Xuan,et al[10]在暴发AHPND 的对虾肝胰腺中分离到一株坎贝氏弧菌，经PCR 检测这株弧菌携带pVA1 型质粒，感染试验也证实了这株病原菌具有致对虾AHPND 的能力；HAN,et al[27]也在患AHPND 的对虾上分离到携带pVA1型质粒的坎贝氏弧菌；目前的研究普遍认为pVA1 型质粒的接合转移可导致新AHPND 致病弧菌的产生。本次试验中分离获得的10 株pirABVP阳性细菌主要以副溶血弧菌、欧文斯氏弧菌和坎贝氏弧菌3 种弧菌为主，实验中鉴定出2 株携带pirABVP阳性坎贝氏弧菌，及1 株pirABVP阴性坎贝氏弧菌，而后者对健康对虾没有致病性。实验结果也从侧面证实pVA1 型质粒可能发生水平转移，导致了养殖环境中新AHPND 致病性弧菌的产生。

陈晓玲等[28]对中国明对虾养殖塘中弧菌数量与AHPND 关系开展调查，结果显示养殖环境中弧菌数量的增多，AHPND 暴发的可能性也会随之升高。本次试验中，试验A 组采用2×108CFU·mL-1高浓度菌液浸泡15 min，再在养殖水体中维持2×106CFU·mL-1菌量进行持续感染，结果副溶血弧菌（1406001）感染组对虾发病最快，72 h 内即出现大量死亡，96 h 死亡率已高达95%，而其他3 株菌感染7 d 内累计死亡率也分别达95%、75%、90%；试验B 组采用2×108CFU·mL-1高浓度菌液浸泡15 min，之后对虾在普通海水中养殖，试验开始后7 d 内，副溶血弧菌（1406001）感染对虾累积死亡率为60%、坎贝氏弧菌（1904001）感染对虾累积死亡率为50%、坎贝氏弧菌（1509001）和欧文斯氏弧菌（1906001）感染对虾累积死亡率均为55%，试验结果表明，养殖水体中弧菌持续存在导致对虾二次细菌感染，致其死亡率明显高于一次细菌感染。弧菌是一种常见的条件性致病菌，一旦在水产养殖环境中大量滋生，将严重危害规模化的养殖，尤其是当对虾本身抵抗力降低时，弧菌就会乘虚而入。倪纯治等[29]发现当养殖池水中弧菌含量高于海区海水中正常菌含量时，虾池的发病概率就会升高。目前暂无有效的药物治疗对虾AHPND，对虾AHPND 的防治主要还是在对虾未发病时采取防重于治的防治措施[30]。因此为了预防对虾AHPND，应定期检测水体和虾体中的弧菌数量，尽可能控制水体中弧菌数量，消除传染源切断传染途径，创造良好的养殖环境，防止其在养殖生产中暴发。