徐 旺，姚 旭，王元初，史卓尧，王 建，蒋佳乐，王海红，曹佳凯，戴晨曦

(江苏海洋大学 环境与化学工程学院，江苏 连云港 222005)

原花青素因其强抗氧化性，被应用于美容保健、食品添加剂和化妆品等行业[1]。原花青素结构决定其所呈现的颜色，因此随着酸碱性的变化，原花青素的化学性能和颜色也随之变化[2-5]。原花青素是热不稳定型色素，受热极易分解失活[6]，且随时间延长和温度增加，其分解速度加快。王立志等[7]发现，当温度高于90 ℃时，经蒸馏萃取得到的原花青素有效成分下降显著，吸光度低于正常水平[8]。光照是加速原花青素分解的重要因素[9-10]。金属离子对原花青素稳定性也有密切关系[11-13]。

原花青素聚合程度对其生理活性影响很大，低聚原花青素的活性明显大于高聚原花青素的活性，而高聚体不易被人体吸收[14-15]。从花生红衣提取物中所得到的原花青素以A型为主，相当一部分是以高聚体的形式存在。不同聚合度的原花青素因为羟基的作用一般都溶于各种含有羟基的有机溶剂中，而低聚体溶于水，但聚合度超过5以上的原花青素难溶于水[16]。所以降低原花青素的聚合度，对提高花青素的抗氧化性能，增加人体吸收效率有很大作用[17]。

目前国内原花青素的水解方法主要有氧化降解法、酸性降解法、碱性降解法和氢化降解法。其中，氧化降解法和氢化降解法因使用难度较高用得较少。国内外对葡萄籽高聚原花青素的水解工艺研究较多，这类聚合物以B型结构为主，水解效率较高[18-20]。但对源自花生红衣提取物中的高聚原花青素的水解研究较少，主要是因其以A型结构为主，水解较困难[21]。

目前测定平均聚合度的基本方法是香草醛法[18]，该法以甲醇为溶剂，将水解后的原花青素各黄烷-3-醇单元与香草醛进行酚醛缩合反应，从而确定原花青素的质量浓度。Blutler等[22]采用改良香草醛法研究发现，当用冰乙酸作溶剂时，香草醛只与原花青素黄烷-3-醇末端发生缩合，由此测出原花青素的浓度，两者结合进而求出原花青素的平均聚合度。有学者曾选用盐酸、冰醋酸来水解葡萄籽原花青素高聚体[18-19]，但盐酸酸性太强，直接将高聚体转化成为花色素，而醋酸酸性太弱，不能完全将原花青素单元间连接键打开。魏冠红[20]选用酸性介于盐酸与醋酸之间的固体酸性树脂作为葡萄籽原花青素水解介质进行试验，树脂与高聚体最佳体积比为1∶ 1，70 ℃下水解2 h，在此条件下葡萄籽原花青素的平均聚合度从6.26下降到2.30，下降了3.96个单位。孙芸等[23]和Sun等[24]选择醋酸为溶剂，将香草醛法体系中的盐酸换成H2SO4，即H2SO4-香草醛法，使产物更单一，减少吸光度测定偏差。原花青素平均聚合度计算见式(1)。

mDP=ρ/(CM)

(1)

式中：mDP为平均聚合度；ρ为质量浓度，g/mL；C为物质的量浓度，mol/mL；M为儿茶素的摩尔分子量，280.94 g/mol。

本研究中，笔者分别用磷酸、柠檬酸和732阳离子树脂等作为水解介质，以平均聚合度为指标考察水解效果，通过选择适当的条件，探索花生红衣原花青素高聚体水解的优化工艺。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

乙酸(≥99.5%)，阜宁新苑化工厂；柠檬酸(≥99.8%)，上海试剂一厂；盐酸(≥99.0%)，南通三江化工有限公司；浓硫酸(≥99.0%)，邹平天鹿化工有限公司；磷酸(AR,≥85%)、香草醛(≥99.0%)和(+)儿茶素水合物(≥95.0%)，上海阿拉丁实业公司；花生红衣提取物(≥96.0%)，宝鸡市森瑞生物化工有限公司；甲醇(≥99.5%)，天津市永大化学试剂有限公司；732型阳离子树脂，南京化学试剂股份有限公司。

1.2 主要仪器

UV-2450型紫外-可见分光光度计，日本Shimadzu公司；BSA224S型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分离花生红衣原花青素高聚物

称量花生红衣提取物原花青素1.00 g，加去离子水30 mL，充分搅拌以促进溶解，室温下静置浸泡24 h。将达溶解平衡的饱和原花青素浸液进行抽滤。滤渣在红外干燥箱60 ℃烘干1 h，称得滤渣(高聚花青素)质量约0.20 g。取一定量滤渣在超声波作用下溶于甲醇，得到甲醇溶液a；取一定量滤渣在超声波作用下溶于水得到水溶液b。

1.3.2 原花青素最大吸收波长测定

原花青素结构单元黄烷醇A环具有间苯二酚结构，与香草醛反应可生成红色络合物。酸化香草醛与原花青素的反应对光敏感，实验均在避光条件下进行。1 mL(+)-儿茶素乙酸溶液中加入 5 mL 4%盐酸和0.5%香草醛乙酸溶液，室温避光反应20 min后，用紫外-可见分光光度计在400～600 nm范围内扫描。

1.3.3 测量平均聚合度

1)测定高聚原花青素的质量浓度。参照文献[25]配制系列不同质量浓度的(+)-儿茶素水合物甲醇溶液。量取0.5 mL原花青素甲醇溶液a或水溶液b，依次加入2.5 mL 4%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，在500 nm用紫外光扫描测得吸光度，计算出溶液a或b中高聚原花青素质量浓度。

2)测定高聚原花青素浓度。参照文献[25]配制系列不同物质的量浓度的(+)-儿茶素乙酸溶液。量取0.5 mL原花青素甲醇溶液a或水溶液b，依次加入0.5 mL 1%香草醛乙酸溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，在500 nm用紫外光扫描测得吸光度，计算对应的高聚原花青素浓度。

3)计算原花青素水解溶液的平均聚合度。0.5 mL原花青素水溶液+ 2.5 mL 30 g/L香草醛+ 2.5 mL 30%硫酸，30 ℃避光反应20 min后测定A500。

硫酸-香草醛法测定原药青素的平均聚合度。取1 mL(+)-儿茶素乙酸溶液，分别加5 mL 4%硫酸和0.5%香草醛的乙酸溶液，先后在不同温度、不同时间反应，分别测定样品吸光度。计算原花青素溶液的平均聚合度。

1.3.4 高聚原花青素加酸催化水解

参照文献[14]考察磷酸、柠檬酸及732型阳离子树脂催化将高聚原花青素水解成寡花青素的效果。然后进一步考察不同的水解温度与水解时间对原花青素水解效果的影响，在此基础上进行正交试验(三因素三水平)，以得到较优的水解条件。

2 结果与讨论

2.1 原花青素最大吸收波长

(+)-儿茶素乙酸溶液在盐酸-香草醛溶液作用下显色后，用紫外-可见分光光度计在400～600 nm范围内扫描，得到原花青素吸收曲线，其最大吸收波长为500 nm。

2.2 原花青素的水解条件

通过高聚原花青素分别加磷酸、柠檬酸和732型阳离子交换树脂催化水解实验，研究不同温度和不同时间对水解结果的影响。

2.2.1 不同温度条件下水解时间对平均聚合度的影响

在40～60 ℃条件下，考察不同温度条件下水解时间对原花青素平均聚合度的影响，结果见图1。

图1 不同温度条件下水解时间对平均聚合度的影响Fig.1 Effects of hydrolysis time on average degree of polymerization of proanthocyanidins under different temperature

由图1可见：在水解温度为40～60 ℃时，不同水解反应时间下，平均聚合度降低最明显的是732型阳离子交换树脂，达到2.0～3.0，其水解反应能在很短的时间即可达到较低的聚合度，但随着水解时间的延长，平均聚合度反而逐渐上升；水解效果较差的是柠檬酸，最差的是磷酸。由此可见，花生红衣高聚原花青素水解程度与催化剂的酸性有一定关系。但是同时发现，并非催化剂酸性越强，高聚原花青素的平均聚合度降低程度越大，因为柠檬酸的酸性弱于磷酸，而它使原花青素降解能力却略高于磷酸，而且柠檬酸和磷酸做催化剂时，水解反应时间长短对水解后原花青素溶液的平均聚合度影响很小。在50 ℃条件下，732型阳离子交换树脂的曲线斜率有所增加，柠檬酸的曲线上移，斜率也有所增加，可见水解温度的提高，对平均聚合度的降低不利。在60 ℃条件下，732型阳离子交换树脂的曲线下移，斜率变得平缓，而柠檬酸的曲线上移较明显，磷酸的催化情况基本不受温度影响。

曹清丽等[15]以亚硫酸氢钠为水解介质，研究葡萄籽原花青素降解时发现，在反应温度80 ℃、反应时间 90 min、样品与亚硫酸氢钠体积比为1∶ 9的条件下，原花青素的平均聚合度为从4.6降为2.3。赵平等[16]研究发现，亚硫酸作为酸介质对葡萄籽原花青素水解后的平均聚合度最大下降了3.54。从亚硫酸和亚硫酸氢钠为水解介质的情况看，前者酸性大于后者(也大于磷酸)，水解效果也更好。而本研究使用732型阳离子交换树脂作为花生红衣原花青素水解介质，在40 ℃，仅用约10 min即可达到类似效果。

2.2.2 水解温度对原花青素平均聚合度的影响

考察水解时间为10～30 min时，不同水解温度对原花青素平均聚合度的影响，结果如图2所示。

图2 不同水解时间条件下水解温度对原花青素平均聚合度的影响Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on the average degree of polymerization of proanthocyanidins at different times

由图2可知：水解反应10 min后，曲线在不同反应温度下732型阳离子交换树脂催化的平均聚合度出现先高后低的趋势；柠檬酸催化效果呈逐渐上升趋势而磷酸催化效果呈直线趋势。因此随着温度的提高，732型阳离子交换树平均聚合度降低越明显，磷酸催化效果变化不大，柠檬酸的催化效果降低，且磷酸和柠檬酸的催化效果更为接近；水解反应15 min后，温度的影响已基本不变。

在同一温度条件下，随着加热时间的延长，磷酸和柠檬酸催化水解的平均聚合度一直在5.0左右，变化不大。在60 ℃时，732型阳离子树脂催化水解的平均聚合度降至2.5左右。由此可见，732型阳离子树脂为水解反应催化剂有利于降低原花青素平均聚合度。初步确定较好反应时间为15 min，反应温度为60 ℃。另外，过高的催化剂与高聚原花青素溶液体积比在反应时，可能因酸过多导致原花青素形成花色素，也会影响水解效果。因此，在单因素的基础上，进一步进行正交试验。

2.2.3 正交设计(三因素三水平)优化水解条件

设计原花青素甲醇溶液与732型强酸性阳离子树脂的体积比、水解温度和时间这3个因素，设置3个不同水平，对水解反应条件进行优化，结果如表1和表2所示。

表1 正交试验设计及结果

由表1和表2可知，3个因素对指标影响次序大小依次为体积比、水解时间、水解温度。因此，优先考虑原花青素甲醇溶液与阳离子树脂溶液的体积比，其次考虑水解时间，最后考虑反应温度对水解实验的影响。

表2 正交试验结果极差分析

3 结论

1)以平均聚合度为指标，考察磷酸、柠檬酸及732型强酸性阳离子树脂等不同类型酸性介质、原花青素甲醇溶液与阳离子树脂的体积比、水解温度和时间等对水解反应的影响。采用硫酸-香草醛法测定水解后原花青素平均聚合度。结果表明，在相同条件下，732型阳离子树脂是最适宜的水解催化剂。

2)通过单因素和正交试验得到优化的水解反应条件：原花青素甲醇溶液与阳离子树脂的体积比为2.0∶ 1，水解温度60 ℃下，反应15 min。原花青素高聚体的平均聚合度最低可降至2.55，有效降低了花生红衣原花青素的平均聚合度。