王世信，杨美娜，崔友祥，闫国强，丁洪青

(1.河北省沧州中西医结合医院中药药学部，沧州 061001；2.河北省沧州中西医结合医院脑病三科，沧州 061001)

芪参还五胶囊是河北省沧州中西医结合医院院内制剂，是由经方“补阳还五汤”与“桃红四物汤”合用加减化裁而来[1]，在该院作为协定处方使用多年，后开发成为医院制剂。该方由黄芪、太子参、桃仁、红花、当归、赤芍、川芎、地龙、全蝎和水蛭等19味中药制成，具有补气活血、祛瘀通络、息风化痰和清热养阴的功效[2]，主治气虚血瘀、痰热蕴结所致的冠心病、脑卒中、卒中后遗症等，均有良好的疗效与安全性[3-4]。本研究对芪参还五胶囊的制备工艺及质量标准进行了研究，以保证该制剂临床用药的安全性及质量可控性。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-10AVP Plus型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Hypersil ODS2 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，大连依利特公司；AG 135型电子分析天平(Mettler Toledo公司)；HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；BJ-3型升降式崩解时限测试仪(济南欧莱博科学仪器有限公司)；硅胶 G薄层版(青岛海洋化工厂)；Arium®pro应用型超纯水系统(德国Sartorius公司)。

1.2试药 清半夏药材，购自山东百味堂药业有限公司；其他药材均购自安徽友信药业有限公司；以上药材均经沧州市药检所鉴定，符合《中国药典》2015年版各药材项下规定。黄芪甲苷对照品(批号110781-201717)、芍药苷对照品(批号110736-201943)、阿魏酸对照品(批号110773-201915)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号111920-201907)、大黄对照药材(批号120902-201912)和水蛭对照药材(批号121061-201806)，均购自中国食品药品检定研究院。3批芪参还五胶囊(批号分别为190522、190601、190615)，均由河北省沧州中西医结合医院中药药学部自制。水为超纯水(实验室自制)；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，均购自上海科旺化学试剂有限公司。

2 芪参还五胶囊的制备工艺优化

2.1芪参还五胶囊处方组成 黄芪120 g，太子参80 g，桃仁40 g，红花48 g，当归40 g，赤芍48 g，川芎40 g，玄参48 g，石决明48 g，钩藤48 g，麦冬40 g，牛膝40 g，大黄40 g，连翘48 g，地龙40 g，水蛭40 g，胆南星60 g，清半夏32 g，全蝎24 g。

2.2芪参还五胶囊的工艺优化 考虑到处方中各药味有效成分的理化性质及生产制备、临床应用的实际情况，以最大限度保留有效成分为原则，拟对处方中的一部分药材进行煎煮提取，另一部分则以生粉入药。

2.2.1药材出粉率的考察 方中大黄有泻下逐瘀的作用，为了充分发挥其泻下功效，宜粉碎生用[5]；水蛭发挥破血逐瘀功效的主要成分为生物酶，不宜加热，故将药材单独粉碎备用[6]；胆南星、清半夏粉性较强，为便于制剂，需粉碎入药[7]；全蝎、太子参相对较贵重，为发挥最大药用价值，留粉备用[8]。分别按照处方量称取上述药材，各3份，置于粉碎机中粉碎后，过100目筛，计算各药材出粉率。结果见表1。

表1 出粉率的考察

2.2.2煎煮药材提取工艺优化

2.2.2.1正交实验设计 根据预实验结果，确定影响水煎煮的3个主要因素分别为：加水倍数、提取时间和提取次数。采用L9(34)设计正交实验，各因素设3个水平，见表2。

表2 正交实验因素与水平

2.2.2.2正交实验 按照处方量分别称取黄芪、桃仁、红花、当归、赤芍、川芎、玄参、石决明、钩藤、麦冬、牛膝、连翘和地龙13味水煎煮药材，共9份。在平行条件下，参照表2进行提取，提取液合并后浓缩至浸膏，再放入烘箱中105 ℃干燥3 h，制得干膏。以干膏得率、芍药苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量为评价指标，优选最佳提取工艺，3个指标的权重系数分别定为0.30、0.35、0.35。正交实验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 正交实验结果

表4 方差分析结果

由表3和表4可知，对水煎煮工艺的影响因素顺序为：提取次数(C)>提取时间(B)>加水倍数(A)，其中提取次数对水煎煮工艺的提取效果差异具有统计学意义(P<0.05)，而加水倍数和提取时间2个因素差异无统计学意义(P>0.05)。根据正交实验及方差分析结果，得出最佳水煎煮的工艺条件为A2B3C3。本着降低生产成本、提高生产效率的原则，结合综合评分结果，可将单次提取时间缩减为1.5 h，得出最佳水煎煮工艺条件为A2B2C3，即药材加水煎煮3次，每次加8倍量水，煎煮1.5 h。

2.2.2.3验证实验 按照处方量分别称取上述13味水煎煮药材，共3份，按照筛选出的最佳水煎煮工艺条件进行3次平行验证实验，结果见表5。由表5可知，3次平行验证实验的干膏得率、芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量结果均较稳定，提示该水煎煮工艺稳定、可行。

表5 验证实验结果

通过对芪参还五胶囊的制备工艺进行优化，确定了其最佳制备工艺：取黄芪、桃仁、红花、当归、赤芍、川芎、玄参、石决明、钩藤、麦冬、牛膝、连翘和地龙13味药材，加水煎煮3次，每次加8倍量水，煎煮1.5 h，合并3次水煎液，滤过，将滤液浓缩至相对密度为1.25；以水蛭、胆南星、清半夏、全蝎、太子参和大黄分别粉碎后(过100目筛)的生药粉收清膏，置于烘箱中105 ℃烘干，将所得干膏粉碎成细粉，装胶囊，即得。

3 芪参还五胶囊的质量标准研究

3.1性状检查 本品为硬胶囊，内容物为黄棕色粉末，气微腥，味苦、涩。

3.2质量检查

3.2.1装量差异 参照《中国药典》2015年版一部[9]附录0103胶囊剂项下要求，取本品10粒，分别精密称定每粒质量和胶囊壳质量，求得内容物质量与平均装量，计算得装量差异在±10%范围内，符合规定。

3.2.2水分 参照《中国药典》2015年版一部[9]附录0832水分测定法要求，取本品胶囊内容物进行水分测定，结果均<9.0%，符合规定。

3.2.3崩解时限 参照《中国药典》2015年版一部[9]附录0921崩解时限检查法要求，取本品6粒，置于崩解时限测试仪中，结果均在30 min内全部崩解，符合规定。

3.3TLC鉴别

3.3.1黄芪 取芪参还五胶囊内容物5 g，加正丁醇30 mL，超声处理40 min，滤过，滤液用0.01 g·mL-1氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20 mL，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水洗涤至中性，弃去水液，将正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。去掉处方中黄芪，按照上述供试品溶液制备方法制成缺黄芪的阴性对照溶液。按照《中国药典》2015年版一部附录Ⅵ B 项下TLC法进行实验，吸取供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，晾干，喷以0.11 g·mL-1的硫酸乙醇，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性未见干扰斑点，见图1A。

3.3.2大黄 取芪参还五胶囊内容物5 g，加甲醇20 mL，浸渍1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加2.5 mol·L-1盐酸20 mL使溶解，水浴加热30 min，冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。将处方中大黄去掉，按照上述供试品溶液制备方法制成缺大黄的阴性对照溶液。按照TLC法实验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，晾干，置于紫外光灯365 nm处检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性未见干扰斑点。见图1B。

3.3.3赤芍 取芪参还五胶囊内容物5 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨试液25 mL洗涤，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。将处方中赤芍去掉，按照上述供试品溶液项下方法制成缺赤芍的阴性对照溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL，对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，晾干，喷以0.053 g·mL-1香草醛硫酸，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性未见干扰斑点，见图1C。

3.3.4水蛭 取芪参还五胶囊内容物5 g，加乙醇20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取水蛭对照药材l g，同法制成对照药材溶液。将处方中水蛭去掉，按照上述供试品溶液制备方法制成缺水蛭的阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.11 g·mL-1硫酸乙醇，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果可见，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色主斑点，而阴性未见干扰斑点，见图1D。

图1 TLC图

3.4含量测定

3.4.1色谱条件 采用Hypersil ODS2 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脱[10-12]，顺序为：0～12 min，10%A～15%A，90%B～85%B；12～15 min，15%A～18%A，85%B～82%B；15～20 min，18%A～22%A，82%B～78%B。3种成分检测波长分别为230、260、320 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL。

3.4.2混合对照品溶液的制备 精密称取3种成分对照品适量，加甲醇制成质量浓度为140.2、5.0、9.8 μg·mL-1的混合对照品溶液。

3.4.3供试品溶液的制备 精密称取芪参还五胶囊内容物5 g，置于具塞量瓶中，加入甲醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min(功率500 W，频率40 kHz)，放冷至室温，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，蒸干，残渣加水 30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用0.01 g·mL-1氢氧化钠洗涤3 次，每次20 mL，弃去碱液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次25 mL，弃去水液，取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至100 mL具塞量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4.4阴性对照溶液的制备 分别去掉处方中黄芪、赤芍、当归和川芎药材，分别制成缺黄芪、赤芍、当归和川芎的阴性胶囊样品，按照3.4.3项下方法分别制得黄芪阴性对照溶液、赤芍阴性对照溶液以及当归、川芎双阴性对照溶液。

3.4.5专属性考察 精密吸取3.4.3项下制备的供试品溶液、3.4.2项下制备的混合对照品溶液及3.4.4项下制备的各阴性对照溶液各10 μL，按照3.4.1项下色谱条件进样检测，见图2。由图2可知，3种成分对照品色谱峰与周围其他组分色谱峰均可分离，且峰形良好，阴性对照色谱在对照品色谱峰相同保留时间位置未见干扰峰。

图2 HPLC图

3.4.6线性关系考察 精密吸取3.4.2项下制备的混合对照品溶液1、2、3、4 mL，分别置于5 mL具塞量瓶中，以甲醇稀释定容至刻度，摇匀，按照3.4.1项下色谱条件进样分析，进样量为10 μL。以稀释后的各混合对照品溶液质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)计算回归方程,得到芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和阿魏酸的回归方程分别为：y1=6 161.8x1+178.62(R12=0.999 7)，y2=5 993.7x2+102.48(R22=0.999 5)，y3=6 162.6x3+16.095(R32=0.999 7)，质量浓度分别在 28.04～140.20、1.0～5.0、1.96～9.80 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

3.4.7精密度实验 精密吸取3.4.2项下制备的混合对照品溶液10 μL，按照3.4.1项下色谱条件重复进样6次，以峰面积计算得3种成分的RSD值分别为0.64%、1.02%、0.88%，结果表明该仪器精密度良好。

3.4.8重复性实验 取同一批芪参还五胶囊(批号190522)6份，按照3.4.3项下方法制得6份供试品溶液，各精密吸取10 μL进样分析，以峰面积计算得3种成分的RSD值分别为0.76%、1.14%、0.92%，表明该方法重复性良好。

3.4.9稳定性实验 取芪参还五胶囊(批号190522)，按照3.4.3项下方法新制备供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，依次吸取10 μL进样分析，以峰面积计算3种成分含量的RSD值分别为0.81%、1.23%、1.07%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.4.10回收率实验 取同一批芪参还五胶囊(批号190522)6份，各精密称取1.0 g，置于具塞量瓶中，依次加入芍药苷对照品(5.440 mg·mL-1)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品 (0.180 mg·mL-1) 和阿魏酸对照品(0.345 mg·mL-1)各0.5 mL，按照3.4.3项下方法制得6份供试品溶液，各精密吸取10 μL进样分析，以峰面积计算3种成分的平均回收率，结果表明该方法回收率良好，见表6。

表6 回收率实验结果 (n=6)

3.4.11含量测定结果 取3批芪参还五胶囊，按照3.4.3项下方法分别制得3份供试品溶液，各精密吸取10 μL进样分析，以峰面积计算得3种成分的平均含量分别为2.724、0.090、0.172 mg·g-1。见表7。

表7 样品含量测定结果

4 讨论

本研究对芪参还五胶囊的制备工艺及质量标准分别进行了研究，由于方中药味较多，对质量控制无法一一鉴别，方中用黄芪为君药，其主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有舒张血管、保护局部缺血器官损伤、减轻血管紧张素引起的内皮细胞损伤等作用[13-16]；芍药苷是赤芍中活血化瘀的主要成分[17]，当归、川芎的主要成分阿魏酸具有抗血小板聚集、缓解血管痉挛等作用[18-20]，这些成分均可被认为是芪参还五胶囊的药效物质基础成分，因其在药材中含量较高且相对稳定，易于进行定量检测，用以把控制剂的质量。本研究参考《中国药典》2015年版和文献中方法，分别考察了甲醇-0.4 mL·L-1磷酸、乙腈-0.4 mL·L-1磷酸和乙腈-1 mL·L-1磷酸3种流动相，发现用乙腈-1 mL·L-1磷酸进行洗脱时各成分的分离效果最好，峰形美观，故选择其作为3种成分的流动相系统。研究又参考文献和《中国药典》2015年版中各成分的最大吸收波长，设定在不同时间段切换不同波长，以保证各成分特征吸收峰的顺利检出。

本研究通过正交实验法筛选出了芪参还五胶囊的最佳提取工艺，对于提高制剂的生产效率和降低生产成本具有积极的意义。方中黄芪、大黄、赤芍和水蛭4味药材的TLC图均显示斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰。HPLC图显示，3种成分对照品色谱峰均可达基线分离，且阴性对照未见干扰色谱峰。综上所述，本研究筛选出的芪参还五胶囊的最佳制备工艺稳定、可行，建立的质量控制方法准确度高、专属性强、重复性好，可作为芪参还五胶囊的质量控制标准，保证制剂质量的稳定可控。