李彦超，周 宁，郑晓珂

(1.河南省食品药品检验所 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 450008；2.河南中医药大学，郑州 450046)

卷柏为卷柏科植物Selaginellatamariscina(Beauv.) Spring 的干燥全草，具有活血通经之功效，主治闭经经痛、癥瘕痞块、跌扑损伤；卷柏炒炭后可化瘀止血，用于吐血、崩漏、便血、脱肛[1-4]。卷柏在中国传统医药中应用广泛，药理研究[5-11]表明，其具有细胞毒、抗微生物、抗炎、降血糖和保护血管内皮等作用，其中的黄酮类成分被认为是卷柏的主要有效成分之一[12-14]。前期实验对卷柏中的总黄酮进行提取纯化研究，并制定了提取工艺。本文主要系统地研究卷柏总黄酮的质量标准：首次以穗花杉双黄酮作为对照，用UV法测定卷柏总黄酮的含量，并用HPLC法测定穗花杉双黄酮的含量；进一步测定重金属及有害元素、有机氯农残和其他检查项。

1 仪器与试药

1.1仪器 SHIMADZU UV-2700型紫外分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；1260 Infinity型高效液相色谱仪，7890A型气相色谱仪(Agilent 公司)；Venusil XBP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(Agela Technologies公司)；AAS-ZEEnit700型原子吸收分光光度计，铅(Pb)空心阴极灯(德国耶拿分析仪器股份公司)；AFS-9530型原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)；XR205SM-DR型分析天平(瑞士Precisa公司)；AS-1型镉(Cd)、铜(Cu)空心阴极灯以及AF-2型砷(As)、汞(Hg)空心阴极灯(北京有色金属研究总院)；ETHOS A型微波消解仪(意大利麦尔斯通公司)；ED16型智能样品处理器(北京莱伯泰科仪器有限公司)；Milli-Q 超纯水处理系统(美国Millipore公司)；HK250型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；ED56干燥箱(德国Binder公司)；SXZ-4-10N型箱式电阻炉(上海一恒科技有限公司)。

1.2试药 穗花杉双黄酮(批号111902-201102，质量分数为90.2%)，购自中国食品药品检定研究院；对照品溶液：Pb(批号211035050)、Cd(批号12062612)、Cu(批号212075097)、As(批号151035-2)和Hg(批号212075009)，均购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；甲醇为色谱纯(德国默克公司)；水为纯化水(自制)；卷柏总黄酮(批号：14040101、14092101、14092102、14092103)，湖南康麓生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1性状 根据卷柏总黄酮实验室小试样品及卷柏总黄酮4批次实际观察，暂定本品性状为淡灰黄色至淡灰绿色的粉末；气微，味淡。

2.2鉴别

2.2.1溶液的制备 精密称取卷柏总黄酮0.02 g，置于100 mL量瓶中，加乙醇80 mL，超声处理10 min，放冷，加乙醇定容至刻度，摇匀，得卷柏总黄酮供试品溶液。精密称取穗花杉双黄酮对照品，用甲醇溶解并稀释成质量浓度为60 μg·mL-1的对照品溶液。乙醇作为空白试剂。

2.2.2色谱条件 Venusil XBP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(70∶30)；流速：1 mL·min-1；检测波长：337 nm。分别精密吸取2.2.1项下制备的卷柏总黄酮供试品溶液、穗花杉双黄酮对照品溶液和空白试剂各10 μL，注入液相色谱仪进行检测。

2.2.3鉴别结果 4批次卷柏总黄酮供试品色谱图中均呈现与穗花杉双黄酮色谱峰保留时间相同的色谱峰。

2.3检查

2.3.1重金属及有害元素 参照《中国药典》2015年版四部通则Pb、Cd、As、Hg、Cu测定法，Pb、Cd用石墨炉原子吸收分光光度法，As用氢化物原子吸收分光光度法，Hg用冷蒸气吸收原子分光光度法，Cu用火焰原子吸收分光光度法进行检测，结果4批次卷柏总黄酮中的Pb、Cd、As、Hg、Cu与《中国药典》2015年版四部通则中的限值比较均在限度范围内。

2.3.2有机氯农药残留 参照《中国药典》2015年版四部通则，用气相色谱法进行测定。结果4批次卷柏总黄酮均未检出有机氯农药残留。

2.3.3干燥失质量 参照《中国药典》2015年版四部通则，结果4批次卷柏总黄酮每克的干燥失质量均小于40 mg，暂定本品干燥失质量为每克小于40 mg。

2.3.4炽灼残渣 参照《中国药典》2015年版四部通则，结果4批次卷柏总黄酮炽灼残渣失质量每克均小于5 mg，暂定本品炽灼失质量为每克小于5 mg。

2.4卷柏总黄酮的含量测定

2.4.1对照品溶液的制备 精密称取穗花杉双黄酮对照品，用甲醇溶解并稀释成质量浓度为80 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4.2供试品溶液的制备 精密量取2.2.1项下制备的供试品溶液，用乙醇定量稀释20倍，混匀，即得。

2.4.3测定波长的选择 分别对2.4.1项下制备的对照品溶液、2.4.2项下制备的供试品溶液以及空白溶剂乙醇在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描。结果表明，穗花杉双黄酮对照品溶液和卷柏总黄酮供试品溶液紫外吸收峰形完全一致，均在337 nm波长处有最大吸收，空白溶剂乙醇符合紫外分光光度法对溶剂的要求[15]，在337 nm波长处无紫外吸收，即对卷柏总黄酮的含量测定无干扰，因此以337 nm作为检测波长。

2.4.4线性关系考察 精密称取穗花杉双黄酮对照品适量，按照2.4.1项下方法制成质量浓度为77.85 μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇分别稀释并定容，作为系列对照品溶液，用紫外分光光度计分别在337 nm波长处测定吸光度值，以质量浓度为横坐标(x)、吸光度值为纵坐标(y)进行线性回归，得回归方程：y1=0.070 7x1-0.014 2(r1=1.000 0)。结果表明，卷柏总黄酮质量浓度在1.56～11.68 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.5精密度实验 按照2.4.1项下方法制备质量浓度为4.67 μg·mL-1的对照品溶液，连续6次测定吸光度RSD值为0.13%。表明仪器精密度良好。

2.4.6稳定性实验 取卷柏总黄酮(批号14040101)，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，制备后每隔2 h测定1次，连续测定12 h，计算卷柏总黄酮的吸光度RSD值为0.51%，表明供试品溶液制备后12 h内稳定性良好。

2.4.7重复性实验 平行取6份卷柏总黄酮(批号14040101)，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，测定其含量RSD值为0.96%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.8回收率实验 精密称取卷柏总黄酮(批号14040101)3组，每组3份，每份10 mg，分别置于100 mL量瓶中，按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，测定吸光度值并计算回收率，结果见表1。

表1 回收率实验结果 (n=9)

2.4.9样品含量测定 按照2.4.2项下方法制备供试品溶液，测定吸光度值，计算含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

2.5穗花杉双黄酮的含量测定

2.5.1测定波长的选择 同2.4.3项下。

2.5.2色谱条件 同2.2.2项下。

2.5.3溶液的制备 同2.2.1项下。

2.5.4系统适用性实验 分别精密吸取2.2.1项下制备的对照品溶液、供试品溶液和空白试剂乙醇各10 μL，注入液相色谱仪，按照2.2.2项下色谱条件进行分析，结果穗花杉双黄酮色谱峰分离良好，空白试剂在相应位置无干扰，见图1。

图1 HPLC图

2.5.5线性关系考察 精密称取穗花杉双黄酮对照品适量，按照2.2.1项下方法制成质量浓度为0.320 0 mg·mL-1的对照品溶液，分别精密量取上述对照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释成质量浓度分别为6.401、16.00、32.00、64.01、160.01、320.03 μg·mL-1的系列对照品溶液；分别精密吸取上述系列对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，于337 nm波长处测定峰面积，以穗花杉双黄酮对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得回归方程：y2=24.712 3x2-8.952 1(r2=1.000 0)。结果表明，穗花杉双黄酮质量浓度在6.40～320.03 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.5.6精密度实验 精密吸取2.5.5项下制备的对照品溶液(64.01 μg·mL-1)10 μL，重复进样6次，测定穗花杉双黄酮的峰面积RSD值为0.33%，表明仪器精密度良好。

2.5.7稳定性实验 取卷柏总黄酮(批号14040101)，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，制备后每隔2 h吸取10 μL进样，连续测定20 h，测定穗花杉双黄酮峰面积RSD值为0.42%，表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

2.5.8重复性实验 取卷柏总黄酮(批号14040101)6份，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，测定并计算穗花杉双黄酮的平均含量为367.8 mg·g-1(RSD=1.54%)，结果表明该方法重复性良好。

2.5.9回收率实验 精密称取卷柏总黄酮(批号14040101)3组，每组3份，每份0.01 g，分别置于100 mL量瓶中。按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入标准曲线方程，计算回收率，结果见表3。

表3 回收率实验结果 (n=9)

2.5.10样品含量测定 取4批样品，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算得最低含量为367.8 mg·g-1，最高含量为390.5 mg·g-1，平均含量为382.3 mg·g-1，RSD=2.69%(n=4)，故暂定卷柏总黄酮中穗花杉双黄酮的含量不低于350 mg·g-1。

3 讨论

3.1紫外标准物质的选择 卷柏总黄酮目前已在药品、保健食品以及日用化学品等诸多方面广泛应用，也广泛研究了卷柏总黄酮的提取工艺和质量标准等，且大多以槲皮苷和芦丁为指标测定总黄酮[16-19]。虽然卷柏总黄酮中也含有槲皮苷和芦丁，但主要由双黄酮组成，而穗花杉双黄酮又是卷柏总黄酮中的代表性成分，具有很强的生物活性[20-22]，可作为卷柏总黄酮的质量判定指标之一；卷柏总黄酮中穗花杉双黄酮占40%以上，二者在紫外光谱图上极其相似，测定方法简便易行，因此以其作为测定指标较合理。

3.2提取方法的选择 本实验考察供试品溶液的制备方法，用甲醇超声提取5、10、15、20 min与回流提取30 min比较，结果回流提取30 min与超声提取10 min以上测得的卷柏总黄酮和穗花杉双黄酮含量基本一致，估计是样品本身为提取物，且为提取后干燥品，较好溶解，故采用本实验的制备方法。

3.3色谱条件的选择 本实验分别从色谱柱和流动相对色谱条件进行了考察，对以下4根色谱柱分别进行了考察：CAPCELL PAK C18(SHISEIDO公司)，phenomenex C18(phenomenex公司)，CHROM-MATRIX C18(CHROM-MATRIX公司)，Venusil XBP C18(Agela Technologies公司)，结果分离度、峰形较好且基线较平稳的为Venusil XBP C18色谱柱。对水、磷酸、冰醋酸和甲酸进行流动相筛选，结果磷酸分离效果较好，在此基础上对不同浓度(0.5、1、2 mL·L-1)磷酸进行比较，结果以1 mL·L-1磷酸为流动相时峰形较好、基线较平稳、对称性好，因此本实验采用上述条件作为最佳色谱条件。