潘林鑫，徐 涛，范礼斌，钱 成

视网膜母细胞瘤蛋白1(retinoblastomal，RB1)是人类第一个成功克隆的抑癌基因，此发现是人类理解细胞周期调控和肿瘤遗传学的里程碑。人RB1基因定位在染色体13q14上，全长约18 kb，其中CDS序列全长2 787 bp，编码包含928个氨基酸残基的核内磷酸化蛋白pRb，其包含N-末端(1～379 aa)、A/B口袋结构域(380～785 aa)和C-末端(786～928 aa)三个结构域，其中RB1羧基端(RB1-C)含有高度保守的亮氨酸链，能促进蛋白与周期蛋白折叠的结合，在蛋白相互作用过程中扮演着重要角色，而RB1-C中丝氨酸和苏氨酸的磷酸化是RB1发挥生物学功能最重要的机制之一。人

SEDL

基因定位在染色体Xp22.12-Xp22.31上，全长约20 kb，其中CDS序列全长420 bp，编码包含140个氨基酸残基的迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(spondyloepiphyseal dysplasia tarda associated protein，Sedlin)，该蛋白在骨骼正常发育、蛋白运输过程中发挥着重要作用。该研究首先探索了RB1-C和Sedlin在细胞中的共定位现象，然后通过构建一系列RB1-C磷酸化位点突变体，检测其蛋白表达和细胞定位情况，并进一步观察这些突变体与Sedlin的共定位情况，确定RB1-C中影响其与Sedlin共定位的磷酸化位点，为接下来研究二者相互作用的关键结合位点提供依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞

pcDNA3.1空载体质粒、pcDNA3.1-FLAG-RB1-C和pcDGFP-Sedlin真核表达载体质粒，DH5α大肠埃希菌感受态菌株，HEK 293T和COS7细胞株均由安徽医科大学生命科学学院生物学实验室保存。

1.2 主要试剂

DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；BamHⅠ、Xho Ⅰ和Dpn Ⅰ限制性内切酶购自上海生工生物公司；质粒小量抽提试剂盒购自美国Axygen公司；细胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、一抗稀释液购自上海碧云天公司；FLAG抗体购自德国Sigma公司；……