李 萍 高丽华 任 卫

（大连市第三人民医院风湿免疫科，大连 116033）

类风湿关节炎是一种以关节肿胀、关节压痛和滑膜关节破坏为特征的慢性炎症性全身自身免疫疾病，可导致严重残疾，其发病率为0.5%～1.0%。通过严密的监测和控制，快速诊断和治疗的方法，可以增加类风湿关节炎患者缓解的可能性[1-3]。miRNA 在类风湿性关节中的治疗潜力已得到很多研究的认可[4-5]。最近，miR-199a 被鉴定为高度保守的miRNA，可在多种细胞类型中调节多种生长行为。miR-199a-3p 在各种细胞中始终显示出抗增殖，抗侵袭，抗炎和促凋亡的作用[6]。以往研究证实，miR-199a-3p 在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中表达下调，且部分通过靶向RB1 抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖并诱导其凋亡[7]。但是miR-199a 在类风湿性关节炎中的功能机制尚未完全清楚。半胱氨酸甘氨酸富含蛋白2（cysteine and glycine-rich protein 2，CSRP2）仅富含半胱氨酸LIM 家族成员，并且包含2 个LIM 域，在各种组织中广泛表达。有研究表明，CSRP2 有助于肌动蛋白骨架的组装和/或维持，抑制血管平滑肌细胞迁移，且在多种肿瘤中发挥重要调控作用[8]。然而，其在类风湿关节炎中的作用尚不清楚。本课题组前期通过生物信息学软件预测显示，miR-199a 和CSRP2 存在特异性结合位点，提示miR-199a 可能靶向CSRP2 参与类风湿关节炎的发展。因此，本研究旨在探索miR-199a 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、侵袭和炎症因子分泌的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A 购自美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）；RT-qPCR 试剂盒购自上海碧云天生物研究所；Transwell 小室购自美国BD Bioscience 公司；DMEM 培养基、胎牛血清均购自北京康为世纪；双荧光素酶报告实验试剂盒购自上海宇玫博生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和分组

MH7A 细胞在37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养、传代，所使用的培养液为DMEM 培养基混有10%的胎牛血清和1%的青链霉素。

将正常培养的MH7A细胞标记为对照组；将用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（100 mg/L）处理48 h的MH7A细胞，标记为LPS组；用3倍质粒量的脂质体混合质粒后转染LPS组MH7A细胞 5 h，在添加培养基继续培养48 h，用RT-qPCR检测转染的效率如何，确认转染成功后，用于后续研究。具体的转染质粒如下：LPS+miR-NC组（转染miR-NC）、LPS+miR-199a组（转染miR-199a mimics）、LPS+miR-199a+pcDNA3.1组（共转染miR-199a mimics和pcDNA3.1）、LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2组（共转染miR-199a mimics和pcDNA3.1-CSRP2）。

1.3 RT-qPCR 检测细胞中miR-199a、CSRP2 的表达

收集各组MH7A 细胞，提取细胞中的总RNA，并转录成为cDNA，用RT-qPCR 试剂盒检测cDNA中miR-199a、CSRP2 的表达。miR-199a 上游引物序 列 为5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGTAACCAAT-3'，下游引物序列为5'-ACACTCCAGCTGGGACAGTAGTCTGCA CAT-3'；CSRP2 上游引物序列为5'-GATCCTCGAG ATGCCTGTCTGGGGAGGTGG-3'，下游引物序列为5'-GATCAGGATCCCGCTGGGCATGAACAAG AGCCC-3'；U6 上游引物序列为5'-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3'，下游引物序列为5'-GG AACGCTTCACGAATTTG-3'；β-actin 上游引物序列为5'-CGTCTTCCCCTCCA TCGT-3'，下游引物序列为5'-GCCTCGTCGCCC ACATAG-3'。以U6、β-actin 为内参，2-△△Ct法计算miR-199a、CSRP2的相对表达水平。

1.4 CCK-8 法检测细胞增殖

取对数期的MH7A 细胞接种到96 孔板中，接种密度为5×104个，48 h 后分别向各组每孔细胞中添加CCK-8 试剂10 μL，孵育箱反应2 h，使用全自动酶标仪测定450 nm 波长处光密度（OD）值。

1.5 免疫印迹检测细胞中CSRP2、p21、E-cadherin蛋白水平

收集各组MH7A 细胞，充分裂解提取总蛋白，并变性。将变性后的蛋白离心取上清进行SDSPAGE 蛋白电泳，将蛋白转移至PVDF 膜上，然后进行2.5%脱脂奶粉封闭处理2 h。将膜分别用一抗CSRP2（1∶1 000）、p21（1∶1 500）、E-cadherin（1∶2 000）处理24 h（4℃），再用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）处理2 h（37℃）。用ECL电化学发光试剂盒进行显影曝光。以目的基因条带与内参条带的灰度值比作为相对蛋白表达量。

1.6 Transwell 法检测细胞侵袭

各组MH7A 细胞先用不含血清的培养基饥饿处理12 h，再取约200 μL 的细胞平铺在小室上表面，取600 μL 含血清的培养基置于小室的下室，37℃培养12 h。轻轻取出小室，缓缓擦去上表面多余的细胞，用甲醛固定膜上发生穿孔的细胞，再用结晶染色。最后将膜进行固定、封片。在显微镜下观察细胞，计数，取平均值。

1.7 ELISA 检测白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量

各组MH7A 细胞按照IL-6 检测试剂盒、TNF-α检测试剂盒的要求进行处理，并按照说明书要求操作，检测IL-6、TNF-α 的含量。

1.8 双荧光素酶报告实验检测细胞的荧光活性

根据mircode（http://mircode.org/）预测的CSRP2 结合核苷酸序列设计含有CSRP2 结合位点的基因片段（WT-CSRP2）和突变的CSRP2 核苷酸序列（MUT-CSRP2），将其克隆至荧光载体psiCHECK2，构建荧光素酶报告基因。将其与miR-NC、miR-199a 共转染至MH7A 细胞。最后按照双荧光素酶报告实验试剂盒要求，检测细胞的萤火虫荧光素酶活性，再检测海肾荧光素酶的荧光活性，结果计算以海肾荧光素酶的活性为内参，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶的活性的比值表示细胞的荧光活性。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件分析。计量资料采用±s表示，多组间的数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，两组间数据比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达miR-199a对MHTA miR-199a、p21、E-cadherin表达和细胞活性及侵袭的影响

与对照组相比，LPS 组细胞中miR-199a 表达显著降低，p21 和E-cadherin 蛋白表达均显著降低，细胞的OD 值显著升高，侵袭细胞数显著升高（P＜0.05）（图1、表1）。提示过表达miR-199a 后能够明显减弱LPS 对细胞的上述调控。

表1 过表达miR-199a 对MHTA miR-199a、p21、E-cadherin 表达和细胞活性及侵袭的影响（n=9，±s）

表1 过表达miR-199a 对MHTA miR-199a、p21、E-cadherin 表达和细胞活性及侵袭的影响（n=9，±s）

*P＜0.05 vs 对照组； #P＜0.05 vs LPS 组、LPS+miR-NC 组

组别 miR-199a p21 E-cadherin OD 值 侵袭细胞数对照组 0.98±0.05 0.29±0.03 0.35±0.03 0.51±0.03 99.00±7.15 LPS 组 0.26±0.02* 0.13±0.02* 0.17±0.02* 1.24±0.05* 231.00±9.34*LPS+miR-NC 组 0.27±0.02 0.12±0.02 0.15±0.02 1.25±0.05 230.00±9.28 LPS+miR-199a 组 0.72±0.04# 0.25±0.02# 0.30±0.03# 0.78±0.04# 136.00±7.59#

图1 各组细胞p21、E-cadherin 蛋白的表达

2.2 过表达miR-199a 对MHTA 炎症因子表达的影响

与对照组相比，LPS 组细胞中IL-6、TNF-α 表达量均显著升高（P＜0.05），提示过表达miR-199a可明显降低IL-6、TNF-α 的表达量（表2）。

表2 过表达miR-199a 对MHTA 细胞中炎症因子表达的影响（n=9，±s，ng/L）

表2 过表达miR-199a 对MHTA 细胞中炎症因子表达的影响（n=9，±s，ng/L）

*P＜0.05 vs 对照组； #P＜0.05 vs LPS 和 LPS+LPS+miR-NC

组别 IL-6 TNF-α对照组 93.16±6.12 23.67±1.08 LPS 组 368.28±9.15* 91.12±3.04*LPS+miR-NC 组 367.56±9.12 91.04±3.01 LPS+miR-199a 组 149.18±7.55# 38.24±2.03#

2.3 miR-199a 靶向CSRP2

通过在线预测网站mircode（http://mircode.org/）预测到miR-199a 与CSRP2 之间存在互补的核苷酸序列（图2）。双荧光素酶实验显示，miR-199a 明显抑制WT-CSRP2 细胞的荧光活性，显著下调CSRP2 mRNA 的表达（表3）。

图2 miR-199a 靶向CSRP2

表3 miR-199a 调控CSRP2 的表达（n=9，±s）

表3 miR-199a 调控CSRP2 的表达（n=9，±s）

*P＜0.05 vs miR-NC 组

组别 WT-CSRP2 MUT-CSRP2 CSRP2 mRNA miR-NC 组 0.98±0.05 1.00±0.05 1.00±0.04 miR-199a 组 0.24±0.03* 1.02±0.06 0.28±0.03*

2.4 过表达CSRP2 对MHTA 细胞活性和侵袭的影响

与LPS+miR-199a+pcDNA3.1 组相比，LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2组细胞CSRP2蛋白表达显著升高，p21、E-cadherin 蛋白表达显著降低，细胞的OD 值显著升高，侵袭细胞数显著升高（P＜0.05）（图3，表4），提示过表达CSRP2 能减弱miR-199a 对MHTA 细胞活性和侵袭的影响。

表4 过表达CSRP2 对MHTA 细胞活性和侵袭及CSRP2、p21、E-cadherin 表达的影响（n=9，±s）

表4 过表达CSRP2 对MHTA 细胞活性和侵袭及CSRP2、p21、E-cadherin 表达的影响（n=9，±s）

*P＜0.05 vs LPS+miR-199a+pcDNA3.1 组

组别 OD 值 侵袭细胞数 CSRP2 p21 E-cadherin LPS+miR-199a+pcDNA3.1 组 0.77±0.04 137±7.61 0.31±0.03 0.26±0.02 0.31±0.03 LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2 组 1.12±0.06* 208±8.82* 0.78±0.05* 0.14±0.01* 0.19±0.02*

图3 各组细胞CSRP2、p21、E-cadherin 蛋白的表达

2.5 过表达CSRP2 对MHTA 细胞炎症因子表达的影响

与LPS+miR-199a+pcDNA3.1组相比，LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2组细胞IL-6、TNF-α的含量均显著升高（P＜0.05）（表5），提示过表达CSRP2能增强miR-199a对MHTA细胞炎症因子表达的影响。

表5 过表达CSRP2 对MHTA 细胞炎症因子表达的影响（n=9，±s，ng/L）

表5 过表达CSRP2 对MHTA 细胞炎症因子表达的影响（n=9，±s，ng/L）

*P＜0.05 vs LPS+miR-199a+pcDNA3.1

组别 IL-6 TNF-α LPS+miR-199a+pcDNA3.1 组 148.98±7.53 38.19±2.04 LPS+miR-199a+pcDNA3.1-CSRP2 组310.52±8.84* 79.23±3.68*

3 讨论

类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，可引起关节和身体其他部位的慢性炎症，其病因尚不清楚[9]。研究显示，成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎发病机制中起着至关重要的作用[10]。类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞直接参与滑膜增生和使局部炎症永久化细胞因子的产生，还有助于调节免疫细胞和蛋白水解破坏细胞外基质、软骨和骨骼[11]。靶向类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞已被公认为是一种新颖的治疗方法，具有潜在改善临床结果并且对全身免疫的影响较小[12]。最近，miR-199a已被证明参与类风湿关节炎的炎性调控过程[13]。Wu 等[14]研究显示，过表达miR-199a-5p 可逆转促炎性脂肪因子内脏脂肪素水平升高诱导IL-6 和TNF-α 产生增加。Wangyang 等[15]报道，在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中miR-199a-3p 表达显著降低，过表达miR-199a-3p 可抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、诱导凋亡。本研究采用LPS处理类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞以模拟其在体内的环境，结果显示，miR-199a 在LPS 诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中表达异常降低，这说明miR-199a 与类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的细胞表型变化具有紧密的相关性。且LPS 诱导的MH7A 细胞的增殖和侵袭能力均显著升高，细胞中炎性因子IL-6、TNF-α 的表达上调，而过表达miR-199a 能够显著减弱LPS 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的损害作用，推测miR-199a 具有潜在的治疗类风湿性关节炎的价值，这与前人的研究结果[14-15]均相一致。

本研究结果还表明，miR-199a 可靶向CSRP2，这可能也是miR-199a 发挥功能的机制之一。CSRP2 是CSRP 基因家族成员之一，编码一组LIM域蛋白，参与发育和细胞分化相关调控过程，与白血病的恶化过程有关[16-17]。Céline 等[18]报道，CSRP2 在缺氧条件下的乳腺癌细胞和肿瘤标本中发生上调，CSRP2 敲低显著抑制了缺氧刺激的MDA-MB-231 细胞中侵袭性伪足的形成，细胞外基质降解和侵袭，而CSRP2 过表达可以增强缺氧条件下缺氧诱导因子1α 耗尽细胞的侵袭能力，提示CSRP2 可通过促进侵袭性伪足的形成，进而促进缺氧诱导的乳腺癌细胞侵袭。本研究结果显示，CSRP2 为miR-199a 的靶标之一，过表达CSRP2后能够明显影响miR-199a 对LPS 诱导 的MH7A 细胞增殖、侵袭和炎性因子分泌的调控。这也说明CSRP2 能够恢复miR-199a 在LPS 诱导MH7A 细胞中的调控作用。

综上所述，miR-199a 可抑制LPS 诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖、侵袭和致炎因子的分泌，其机制可能与靶向CSRP2 有关，为类风湿关节炎的治疗提供新的方向。