崔 阳

（河北医科大学附属燕达医院神经外科，廊坊 065201）

癫痫发病后往往会使患者出现不同程度的脑功能异常[1-2]。根据最新WHO 数据显示[3]，癫痫患病率为3.5%～4.8%。因此，对于癫痫病的病因以及特异性药物的开发或临床治疗手段的寻找至关重要。研究表明机体免疫系统功能的异常与癫痫的发病原因存在一定的相关性[4]。关于癫痫发病机制的假说主要集中于离子通道或神经信号通路等[5-6]。研究显示机体免疫系统是癫痫的发病基础，并显示大量的细胞因子如白介素家族蛋白或某些炎性分子在癫痫发病过程中担任极其重要的角色，其中对白细胞介素（interleukin，IL）1β（IL-1β）、IL-2、IL-8 的研究相对较为丰富。炎性因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）也共同参与了癫痫的形成，并与神经系统的异常变化密切相关。凋亡蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其基因控制着海马神经元的正常或缺陷，因此凋亡蛋白的上调或下调也控制着癫痫的发生和发展[7]。高压氧治疗能明显改善组织缺血缺氧，改善炎性反应，降低对组织的免疫损伤，保护神经功能的作用。因此本研究旨在通过探讨高压氧对癫痫神经免疫的影响，为高压氧对癫痫的治疗提供部分理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究选择8 ～10 周龄的健康雄性SD 大鼠36只，体质量为180 ～220 g，实验动物购于北京维通利华实验动物中心。

1.2 试剂和仪器

氯化锂、匹罗卡品、水合氯醛、ELISA 试剂盒购自江苏宝莱生物科技有限公司；RIPA 细胞/组织裂解液购自上海生工有限公司；4%多聚甲醛、蔗糖、YLC 0.5/0.8 型高压氧舱购自上海701 所；Statfax 4200 型酶标仪购自美国AWARENESS 公司；Microfuge 20R 型冷冻离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司；DMI3000B 型荧光显微镜购自德国Leica 公司。

1.3 实验分组与癫痫模型制备

采用随机数字法将36 只SD 大鼠进行编号，1 ～12 号实验动物设置为空白对照组，剩余24 只动物接受匹罗卡品法建立癫痫模型[8]，建模过程如下：腹腔注射氯化锂溶液 （125 mg/kg），18 h 或20 h 后再腹腔注射30 mg/kg 匹罗卡品溶液，30 min后，根据Racine 评分标准对大鼠行为评价，如评价等级达到4 或5 级则认为达到癫痫标准，如无癫痫发作或未达到4 或5 级则再次注射匹罗卡品，直至达到癫痫标准，最多注射次数为4 次。将24 只癫痫建模成功的动物随机分为2 组，分别为模型组和干预组，每组12 只。

1.4 治疗方法

对干预组动物进行高压氧治疗干预，具体操作如下：首先对高压氧舱各项参数进行设定，将氧舱内设置为高氧气浓度（80%～90%），每日进行1 次治疗，30 min，7 d 1 个疗程，每只实验动物均接受21 次高压氧治疗。每个疗程治疗后，停止3 d，以防动物在治疗期间出现氧气中毒或减压疾病[9]。

1.5 标本采集与处理

高压氧治疗后将全部动物行腹腔注射10%的水合氯醛实施麻醉以采集标本。将实验动物四肢固定于解剖板，用剪刀小心剪开腹腔，利用导管负压状态下抽取下腔静脉血3 ～5 mL，3 000 ～3 500 r/min 冷冻离心20 min，收集血清并于-20℃贮存。采用ELISA 法对实验动物血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 水平进行测定。将动物颈椎脱臼法处死，快速取海马组织，部分海马组织进行匀浆，并用RIPA 细胞/组织裂解液裂解，贮存于-80℃，用于免疫印迹检测。剩余部分海马组织用PBS 洗涤后进行4%多聚甲醛固定，浓度为30%的蔗糖溶液脱水，待组织下沉后可进行中性树脂包埋，冷冻切片机制作超薄切片后贮存于-80℃，用于免疫荧光染色检测[10-11]。

1.6 ELISA 检测

参照ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 的表达量。

1.7 免疫印迹检测[12]

在癫痫发作后不同时间点分别断头取血，分离血清。同时取脑，迅速剥离海马，匀浆，取上清，将血清和匀浆液置于-70℃待测。RIPA 细胞/组织裂解液后的海马组织样品与等体积的2×上样缓冲液，混匀后100℃煮样10 ～15 min，待SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。首先配制12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶对总蛋白进行分离，浓缩胶电压设置为70 ～80 V，待电泳至分离胶时可调节电压至120 ～130 V，根据蛋白Marker 条带显示至凝胶底部时停止电泳。电泳结束后将凝胶蛋白转移至PVDF 膜，转膜参数设置为恒定电流300 mA，时间80 ～90 min，总蛋白转移至PVDF 膜后利用5%的脱脂牛奶封闭非特异性抗原2 h，根据Marker 条带蛋白大小显示针对Bax、Bcl-2 蛋白进行鼠抗或兔抗过夜孵育，PBST 洗涤PVDF 膜3 次，每次5 ～10 min 即可，然后进行HRP 标记的羊抗鼠或羊抗兔抗体进行二抗孵育，室温1 ～2 h 即可进行ECL 发光检测，所得条带使用Image J 软件定量或分析。

1.8 免疫荧光染色检测[13]

将制备的冷冻切片取出，PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，为消除内源性过氧化氢酶活性加入0.3%过氧化氢，再次PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，然后利用浓度为5%的牛血清白蛋白孵育2 h 以封闭非特异性抗原，封闭后无需PBS 漂洗可直接进行Bax 和Bcl-2 鼠抗或兔抗孵育，4℃，24 h，PBS 漂洗3 次，每次漂洗3 ～5 min，使用带有荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔HRP室温孵育1 ～2 h，即可于荧光显微镜下进行拍照观察。利用Image J软件分析阳性细胞数目，总细胞数至少观察200个，每组重复3次，取平均值比较。

1.9 统计学处理

本研究采用统计软件SPSS 19.0 处理数据，以百分比率（%）表示计数资料，行χ2检验；以±s表示计量资料，行t检验，当P＜0.05 时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高压氧治疗对癫痫大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表达的影响

与空白对照组相比，癫痫模型组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平均显著升高，IL-2表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经过高压氧治疗干预后，与癫痫模型组相比，实验大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平显著降低，IL-2表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此，癫痫病的发生发展与白介素家族基因表达水平具有一定相关性（图1）。

图1 高压氧治疗对癫痫大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表达的影响

2.2 各组海马神经元Bax 和Bcl-2 的表达变化

免疫印迹检测结果显示，空白对照组SD 大鼠海马组织Bax 蛋白光密度值最低，癫痫模型组大鼠海马神经元Bax 蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经过高压氧治疗干预后，Bax 蛋白水平显著下调。与空白对照组相比，癫痫模型组抗凋亡蛋白Bcl-2 在海马神经元中表达显著下降，经过高压氧治疗干预后，该蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。因此，海马神经元凋亡因子的表达预示癫痫疾病的发作过程（图2）。

图2 免疫印迹检测Bax 和Bcl-2 光密度的定量结果

2.3 海马神经元Bax 和Bcl-2 的相对变化情况

免疫荧光染色检测结果显示，与空白对照组相比，癫痫模型组大鼠神经元Bax 阳性神经元数量显著升高，而Bcl-2 阳性神经元数量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经过高压氧治疗干预后，Bax 阳性神经元数量明显降低，而Bcl-2 阳性神经元数量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此，该结果也进一步证明了海马神经元Bax 和Bcl-2 的相对变化与癫痫具有相关性（图3）。

图3 免疫荧光检测Bax（A1～C1）和Bcl-2（A2～C2）阳性神经元数

3 讨论

IL-1β 是一种细胞调节因子，属于白介素-1 家族成员之一，许多免疫系统异常疾病均与该调节因子的异常表达或分泌相关[14-15]。根据最新研究表明，与正常人群相比，癫痫患者外周血血清中IL-1β 的表达水平明显升高，同时该调节因子的表达水平甚至可以对神经元受损程度提供一定的参考依据。IL-1β 在癫痫患者中显著升高主要原因之一为该因子可在体内刺激分泌细胞分泌，并释放其他炎性因子，以促进癫痫的发生发展。IL-2 是机体在受到外界应激时产生的糖蛋白，能够刺激并促进T 细胞生长，因此该细胞调节因子的主要功能为调节人体免疫反应以应对不良外界条件[16-17]。癫痫患者血清中IL-2 水平与正常人相比明显较高，因此大量国内外研究证实该调节因子通过调节免疫系统参与癫痫的发病过程。IL-8、TNF-α 是2 种机体分泌的炎性因子，能够导致局部组织的炎症反应，目前关于两者与癫痫之间关系的研究还相对较少[18]。近年来随着对癫痫深入研究表明，该疾病发病过程中具有细胞凋亡现象，凋亡因子的上调或下调最终引起海马神经元细胞发生程序性死亡。Bax 和Bcl-2 分别为促凋亡基因和抗凋亡基因，因此该对基因的相对表达可诱导凋亡的发生，并参与癫痫的发病过程[19-20]。

本研究结果显示，与空白对照组相比，癫痫模型组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表达水平均显著升高，IL-2 表达水平明显降低，经过高压氧治疗干预后，与癫痫模型组相比，大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表达水平显著降低，IL-2 表达水平明显升高，表明癫痫的发生发展与白介素家族基因表达水平具有一定相关性。与空白对照组相比，癫痫模型组促凋亡蛋白Bax 表达显著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达显著下降，经过高压氧治疗干预后，Bax 蛋白水平显著下调而Bcl-2 蛋白水平显著上调。因此，海马神经元凋亡因子的表达调控癫痫疾病的发作过程。免疫荧光染色对海马神经元凋亡因子Bax 和Bcl-2 的阳性神经元数量评估显示，与空白对照组相比，癫痫模型组大鼠神经元Bax 阳性神经元数量显著升高，而 Bcl-2 阳性神经元数量显著降低，经过高压氧治疗干预后，Bax 阳性神经元数量明显降低，而 Bcl-2 阳性神经元数量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此，该结果也进一步证明了海马神经元凋亡基因Bax 和Bcl-2 的相对变化与癫痫具有相关性。