谭丽媛，翟康欣，遆安航，李思思，刘 瑞，郭爱玲，张淑蓉

（山西中医药大学中药学院，山西 晋中 030600）

急性上呼吸道感染是常见疾病，全年都可发生，由病毒和细菌引起，由于感冒的致病原主要是病毒，而且其种类繁多，目前尚未找到理想的具有特殊疗效的疫苗和药物，仍处于对症治疗阶段［1-3]。贾六金主任医师是首届全国名中医，从事中医儿科临床及教学四十余载，擅长治疗儿科呼吸系统疾病，他自创的贾氏银柴退热汤由金银花、连翘、柴胡、黄芩等药材组成，具有辛凉解表、清热解毒、利咽透邪之功效，主治小儿急性上呼吸道感染等疾病［4-6]，为银翘散和小柴胡汤加减组合而成，通过适当的配伍可达到标本兼治的效果，疗效肯定，用药易得，南北通用，真正做到了价廉效验，具有广泛的应用和开发前景［7-13]。

提取工艺作为复方中药制备的关键环节，将直接影响其质量。本实验采用Box-Behnken 响应面法优化贾氏银柴退热汤提取工艺，以期为该制剂后期开发应用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters 高效液相色谱仪，配置Waters 2998 检测器、Empower 工作站（美国Waters 公司）；AE240 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；FA2104 电子天平（万分之一，上海精密科学仪器有限公司）；H66MC 超声波清洗机（无锡超声电子设备公司）。

1.2 试剂与药物 黄芩、柴胡、金银花等药材购于安国市聚药堂药业有限公司、河北全泰药业有限公司、亳州市远光中药饮片厂、安徽盛堂中药饮片有限公司，连翘采自山西晋中（蒸制30 min 后在60 ℃以下烘干），所有药材经山西中医药大学中药鉴定教研室裴香萍副教授鉴定为2015 年版《中国药典》 收载品种。绿原酸（批号 110753-201716）、黄芩苷（批号110842-201508）对照品购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（批号12960217，瑞典欧森巴克化学公司）；甲酸为色谱纯（批号20141021，天津市光复科技发展有限公司）；甲醇为分析纯（批号20140110，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 绿原酸、黄芩苷含量测定

2.1.1 色谱条件 BDS HYPERSIL C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温室温；检测波长330 nm。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品绿原酸1.90 mg、黄芩苷2.30 mg，甲醇定容至10 mL 量瓶中，摇匀，即得（每1 mL 分别含2 种成分0.38、0.46 mg）。

2.1.3 供试品溶液制备 按照处方比例取金银花、柴胡、连翘等药材，蒸馏提取挥发油，蒸馏后水溶液用另外容器收集，药渣与板蓝根等其余药材加12 倍量水煎煮2 次，每次1 h，合并煎液与水溶液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20（80 ℃），60 ℃下干燥。精密称取汤剂提取物0.5 g，置于密塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，称定质量，超声（功率250 W、频率45 kHz）提取40 min，取出，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 阴性样品溶液制备 按方剂处方和工艺，分别制备缺金银花、缺黄芩的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分峰形对称，分离度良好，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.1.6 方法学考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得到回归方程分别为绿原酸Y=125 858X+3 519.2（r=0.999 9）、黄芩苷Y=487 976X+13 907（r=0.999 8），分别在0.04～0.38、0.05～0.46 mg/mL 范围内线性关系良好；精密度、重复性、稳定性（12 h）试验中绿原酸、黄芩苷峰面积RSD 均小于3%，表明仪器精密度、方法重复性、溶液12 h 内稳定性良好；绿原酸、黄芩苷平均加样回收率分别为105.06%、107.24%，RSD 分别为1.55%、2.12%。

2.2 单因素试验 以绿原酸、黄芩苷转移率的加权值（Y）为评价指标（Y=绿原酸转移率×50% +黄芩苷转移率×50%），对浸泡时间（30、45、60、90、120 min）和煎煮时间（30、45、60、90、120 min）进行考察，结果见图2。

图2 单因素试验结果

2.3 Box-Behnken 响应面法 以煎煮时间（A）、煎煮次数（B）、加水量（C）为影响因素，“2.2”项下加权值（Y）为评价指标，设计三因素三水平15 组试验，因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。由此可知，因素B 有极显著影响（P ＜0.01），而因素A、C 无显著影响（P ＞0.05）；B2有极显著影响（P＜0.01），而因素A2、C2无显著影响（P ＞0.05）；因素AB、AC、BC 无显著影响（P ＞0.05）。回归方程为Y=38.26+5.96B-8.26B2，相关系数R2=0.964 4，表明拟合情况良好，工艺可行［14-15]；调整相关系数R2=0.900 4，能解释90.04%响应值的变化，可用于预测分析。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

表4 方差分析

通过Design Expert 软件对表3 数据进行响应面分析［16-17]，结果见图3。图3a（固定加水量10 倍）直观显示，煎煮时间不变时随着煎煮次数增加，响应值先升高后趋于平稳，而煎煮次数不变时随着煎煮时间延长，响应值保持平稳，即煎煮次数2 次或3 次时响应值最高，而煎煮时间对其影响不大；图3b（固定煎煮时间90 min）直观显示，煎煮次数不变时随着加水量上升，响应值缓慢升高，而加水量不变时随着煎煮次数增加，响应值先升高后趋于平稳，故煎煮次数2 次或3 次，或加水量为12 倍时响应值最高；图3c（固定煎煮次数2 次）直观显示，煎煮时间不变时随着加水量上升，响应值逐渐升高，而加水量不变时随着煎煮时间延长，响应值趋于平稳，故加水量12 倍时响应值较高，而煎煮时间对其影响不大，综上所述，直观所得最优工艺为煎煮时间60 min，煎煮次数2 次，加水量12 倍；软件所得最优工艺为煎煮时间120 min，煎煮次数3 次，加水量10倍，2 种方法所得结果差异较大，需作进一步考察。

图3 各因素响应面图

2.4 验证试验 将直观、软件所得优化工艺参数各取3 批进行验证试验，结果见表5。由此可知，2 种方法所得结果无明显差异，考虑到提取效率、资源成本，最终选择直观所得优化工艺，即煎煮时间60 min，煎煮次数2 次，加水量12 倍。

表5 验证试验结果（n=3）

3 讨论

3.1 提取条件优化 本实验针对贾氏银柴退热汤中有效成分绿原酸、黄芩苷极性较大的特点，考察了提取溶剂（50%甲醇、75% 甲醇、甲醇、稀乙醇、无水乙醇）、提取方法（超声、加热回流）、提取时间（15、30、45 min）、溶剂用量（25、50、100 mL），最终确定“2.1.3”项下提取条件。

3.2 因素水平确定 中药成分复杂，是其具有多种功效或药理作用的物质基础。文献大多以加水量、煎煮时间、煎煮次数、浸泡时间为优化中药提取工艺的影响因素；课题组前期对浸泡时间、煎煮时间进行了单因素试验，发现不同浸泡时间下有效成分转移率无明显差异，故未列入Box-Behnken 响应面试验中；随着煎煮时间延长，有效成分转移率呈递增趋势，考虑到大生产实际情况，将其确定为60～120 min。另外，工厂大生产时不仅要关注产率，更重要的是能耗及成本问题，结合文献可知煎煮次数一般不超过3次，故本实验将其确定为1～3 次；贾氏银柴退热汤中大多为草、叶等松泡类药材，加水量过少时难以浸没药材，而过多时能耗态大，故将其确定为8～12 倍。