陆周翔 陶 松

浙江中医药大学附属湖州中医院 浙江 湖州 313000

本研究旨在构建肾阳虚类风湿关节炎(RA)骨质疏松（OP）的中医病证结合模型，探讨肾阳虚在RA-OP中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级DBA/1(H-2q)小鼠，雄性，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。在温度22±2oC，湿度50%～60%，光照12h光明和10h黑暗的环境明暗交替，换风次数15～20次/小时的环境下，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心，实验饲养室许可证号SYXK（浙）2018-0012。

1.2 试剂与仪器：牛Ⅱ型胶原（Chondrex，批号：Chondrex 20022)，弗 氏 佐 剂（Chondrex，批 号 ：Chondrex 7001,Chondrex 7002)，小鼠白细胞介素17(IL-17)ELISA试剂盒（酶免，批号：MM-0170M1），小鼠骨保护素(OPG)ELISA试剂盒（酶免，批号：MM-0144M1），SYBR Green qPCR试剂盒（康为世纪，批号：CW2601），逆转录试剂盒（康为世纪，批号：CW2569），RIPA裂解液（碧云天，批号：P0013D），PMSF（碧云天，批号：ST506）。酶标仪（MD公司），核酸定量仪（Thermo Scientific），实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）。

1.3 肾阳虚小鼠模型建立：取10只雄性DBA/1(H-2q)小鼠，皮下注射20mg·kg-1氢化可的松，每日1次，连续7d，进行小鼠肾阳虚造模；末次注射7d后进行类风湿关节炎的OP造模。

1.4 牛Ⅱ型胶原RA造模：取10只肾阳虚小鼠和10只正常小鼠进行RA造模，牛Ⅱ型胶原（sigma）以2.0mg/ml溶解在0.05mol/L醋酸（2.96ml乙酸用水稀释至1000ml）中，4℃过夜，逐滴加入等体积冷的完全弗氏佐剂（含有1mg/ml灭活的结核分枝杆菌）中后进行注射器乳化。第1天（第0周），每只小鼠接受0.1mg/0.1ml胶原，尾跟部2～3cm处皮内注射。免疫之后21天（第3周），动物接受完全相同的二次加强注射。造模成功后，RA-OP组（10只），肾阳虚型RA-OP组（10只）；另取10只正常DBA/1(H-2q)小鼠作正常组。

1.5 动物体重及足趾肿胀度：二次免疫后，持续8周，每周监测小鼠体重变化，测量足掌厚度获得肿胀程度。……