梁晓玉，崔周磊，王洪成，陈华友

(江苏大学 生命科学研究院，镇江 212013)

木质素过氧化物酶(Lignin peroxidases，LiP)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)、漆酶(Laccase，Lac)等构成了白腐菌的主要木质素降解酶系，与木质素降解辅助酶系协同降解木质素。LiP主要来源于真菌，是血红素过氧化物酶超家族Ⅱ类过氧化物酶中的一员。在木质素降解酶系中，LiP氧化还原电位比MnP、Lac高，除降解木质素外，还能降解生态系统中其他难降解的高分子化合物，这提高了LiP的应用价值。LiP在化学化工、生态修复、生物饲料等行业具有广阔的应用前景，是当前研究的热点，本文综述了近年来LiP的研究进展，并对其研究前景进行展望。

1 LiP的催化机制

LiP有一个所谓的配体通道，可使小分子底物通过通道与血红素直接作用。底物的大小和理化性质共同决定其能否通过配体通道与血红素反应。Ecker等[1]研究发现，除草剂阿特拉津进入配体通道后与通道中某些氨基酸残基结合，最终无法到达血红素腔活性位点。这类物质与配体通道结合后能否再被释放出来，其与配体通道结合时是否会阻碍其他底物对血红素腔的可及性，以及是否会对LiP的其他活性位点产生影响，值得深入探究。目前对配体通道中氨基酸残基了解有限，明确配体通道中关键氨基酸残基、分析配体通道的功能是下一步研究的方向，这有利于深入了解LiP作用机理，并对LiP改性提供参考。

木质素等大分子物质无法通过通道与血红素作用，而是通过酶表面氨基酸残基经长电子转移机制最终与血红素反应。Sandra等[2]提出长电子转移机制两种可能的电子转移路径，一种是Phe’s 路径，按照Trp171-Phe205-Trp251的顺序转移自由基，另一种被称为Phe#2’s 路径，按照Trp171-Asp264-Phe265-Phe267 的顺序转移自由基，这两种转移路径与多功能过氧化物酶中发现的电子转移路径类似。虽然对LiP这两个氧化位点有了初步了解，但它们之间的联系尚不清楚。

藜芦醇(Veratryl alcohol，VA)既可作为LiP催化底物，也可充当LiP催化反应的介质，提升酶促效率。有研究认为LiP氧化VA生成的芳基阳离子自由基VA+·可以扩散到周围体系中，拓展LiP作用范围。这种假说被Houtman等[3]否定，他们以黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)LiP(H8)为研究对象，认为真菌LiP不使用VA+·作为扩散的木质素降解氧化剂，但实验中并未涉及其他LiP同工酶，对是否存在LiP以VA+·为扩散氧化剂还需进一步研究。

2 LiP酶活测定

基于毛细管电泳的胶束电动色谱法可应用于未纯化、未浓缩的微量LiP酶活测定。胶束电动毛细管色谱法是色谱和电泳分离原理相结合的一种复合方法，首先通过电泳分离目标产物，然后通过色谱进行定量分析[4]。Airi等[5]已成功应用该方法测定LiP活性。研究发现，某些底物如VA和Mn2+，LiP和MnP均具有氧化能力，但它们对同种底物氧化的能力不同，Sumire等[6]基于此，应用胶束电动毛细管色谱法成功测定了LiP和MnP混合体系中LiP和MnP活性。这种基于酶活差异同时测定混合体系中不同酶酶活的方法理论上适用于两种或两种以上酶的混合体系，但使用时体系中酶的种类要与底物种类一致，否则难以计算。

胶束电动色谱法灵敏、准确，且样品无需浓缩，可直接用于酶活测定，但其对设备要求较高，实验条件限制了胶束电动色谱法的广泛推广。目前LiP酶活测定主要还是通过分光光度计进行，VA、天青B等物质均可作为分光光度法测LiP酶活的底物。藜芦醇氧化法测LiP酶活的原理是LiP在H2O2存在时催化VA转化为藜芦醛，根据310 nm处吸光度变化值计量LiP酶活[7]。天青B法通过监测OD651处吸光度变化计量LiP酶活。酶活测定时，310 nm处吸光度易受粗酶液中芳香化合物及其他过氧化物酶干扰，651 nm处吸光度受此影响较小，但天青B法测定时间较长，因此，当测量体系中干扰较多且时间允许时，可选择天青B法；当测量体系干扰较少时，藜芦醇氧化法更加便捷。

对比不同研究发现，即使选择同种底物，LiP酶活测定体系中缓冲液、pH值、反应体系也存在差异[8-10]，这使得不同研究中的LiP酶活不具有对比性，因此，亟须制定LiP酶活测定的统一标准。

3 LiP克隆表达

天然产LiP菌株产酶不稳定，表达量低，所产LiP其性质多不适用于工业生产，因此，人们将LiP异源表达以提高LiP的表达量、改善LiP的理化性质，使其更满足人们的应用需求。LiP主要在大肠杆菌中过表达，获得纯品蛋白后进行酶学鉴定。值得注意的是，木质素降解酶类其酶学性质鉴定多以木质素结构类似物为底物，缺乏真正意义上以秸秆中木质素为底物的性能评估。崔周磊等[11]将来源于白囊耙齿菌(Irpexlacteus)的MnP在大肠杆菌中异源表达，以木质素为底物评估所得MnP效能，所得MnP可使玉米秸秆、麸皮中木质素降解率分别可达35.8%和27.3%，这种酶活鉴定方法使得酶的应用潜力更加直观。

虽然已有数个LiP在大肠杆菌中成功过表达，但目的蛋白多以包涵体形式产生，分离纯化复性不便，且其生物安全性存在疑问，工业化尤其是食品工业级应用困难。出于工业化应用的目的，LiP克隆表达需要选择合适的受体菌。LiP在其他表达系统如黑曲霉、杆状病毒等克隆表达的研究也有报道，但应用价值较低[12-13]；肖建龙等[14]在食品微生物酿酒酵母中成功表达有活性LiP，但实用性未知。枯草芽孢杆菌作为饲用菌种，一般具有生物安全性，且生长速度快，能够产生大量胞外蛋白，因此有望作为LiP胞外表达的工业级宿主。目前已筛选得到可以胞外分泌LiP的枯草芽孢杆菌[8]，为提升LiP胞外表达量，需要进一步优化启动子和信号肽。由于酿酒酵母的ADH7启动子可以在木质素衍生物香兰素浓度达到一定限度时启动目的基因表达降解香兰素[15]，香兰素既是诱导物又是底物，这类高效低成本产LiP的启动子有望应用于工业大规模生产LiP。

工业化应用时，LiP需要耐受环境因素的影响，天然LiP稳定性不高，耐受能力不强，因此，除通过基因工程提升酶的产量外，还应提升酶的稳定性，使其更能耐受环境影响。Semba 等[16]构建真菌过氧化物酶系统发育树，推断真菌LiP祖先氨基酸序列，并设计多个含有祖先氨基酸残基的突变酶，所得突变酶热稳定性优于野生型；Karla等[9]构建LiP基因的随机诱变文库，所得突变LiP能耐受更高浓度的H2O2；Le等[17]在黄孢原毛平革菌LiP(H8)中引入盐桥，提高了LiP的耐酸性，工程酶在极端酸性条件下的半衰期提高了12.5倍。耐受极端环境的酶可以拓宽酶的工作范围，其合成对LiP工业化应用具有重大意义。

4 LiP与木质素降解

木质素是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇3种醇单体聚合而成的高分子化合物，这些醇单体通过碳碳键、醚键互相偶联，然后通过自由基机制聚集形成木质素聚合物[18]，这种聚合物包被着纤维素和半纤维素，且本身结构紧密，限制木质纤维素的利用。

LiP在H2O2存在时可以氧化各种酚类芳香底物、非酚类木质素以及一系列氧化还原电位高于1.4 V的化合物，被认为是木质素降解最高效的酶[19]。LiP催化非酚类木质素降解时，从酚或苯环上提取一个电子生成自由基，然后通过后续的非酶反应经侧链裂解、去甲基化、分子内加成和重排等方式破坏木质素分子的主要化学键，导致木质素降解[20]。LiP催化木质素中的芳香环发生裂解，裂解生成的酚衍生物转化为醌类化合物后，经一系列酶的协同作用，以纤维二糖酸内酯的形式进入三羧酸循环或戊糖磷酸途径，终产物为CO2[21]。LiP降解木质纤维素的效果多用木质纤维素降解率衡量，此外，LiP降解木质纤维素后还原糖、总酚量、酚羟基含量等指标也被用于描述木质素降解程度[22-23]，因木质素降解产物多样[24]，多指标相互验证才能更准确地评估LiP降解木质素的效果。

5 LiP的协同作用与应用前景

5.1 LiP用于化工行业

LiP可降解黑色素，可替代美白产品中常用的苯二酚[7]。LiP的催化活性依赖于H2O2，但高浓度的H2O2会导致LiP失活，因此，美白产品中需要持续存在低浓度的H2O2。HO等[25]在美白产品中协同LiP与葡萄糖氧化酶，利用葡萄糖氧化酶生成的H2O2催化LiP对黑色素脱色，避免了高浓度H2O2使LiP失活，提高了黑色素的脱色效率。此外，LiP降解木质素产生的二元羧酸、小分子酚类物质等是重要化工原料，如：LiP降解木质素产生的香兰素可代替天然香兰素用于食品、化妆品行业；LiP作用于木质纤维素，脱木质素后作为原料生产乙醇等。LiP在化学化工行业的更多应用潜力尚待挖掘。

5.2 LiP用于生态修复

生态系统中的纺织废水、农药、抗生素等有机化合物严重威胁着人类健康，但环境中这些污染物浓度较低，且种类多样，LiP虽然具有很强的降解这些污染物的能力，但其产量少，难以大规模投放；底物谱有限，单独作用效果不佳[26]。Pylypchuk等[27]将辣根过氧化物酶与LiP固定到纳米粒子上，多酶协同固定化不仅使酶作为催化剂可以重复使用，还提高了污染物的降解效率。pail等[28]将产LiP的细菌和其他细菌同时投放到纺织废水污染的土地上，发现混合微生物的染料脱色和解毒作用比单菌株更明显。多酶或菌酶协同一定程度上提升了酶的利用效率，然而，这种投放方式针对性不强。根据底物特征，有规划地投放合理的复合酶系能更有效地提升利用率，这需要我们在投放之前能够明确体系中底物种类及其与酶的作用潜力。Berbar等[29]首次尝试并建立了一套评估底物对酶敏感性的理化指标，评估了25种有机污染物的氧化还原酶敏感性，敏感性评分与降解率基本一致。类此，建立LiP对底物敏感性的理化指标，评估底物敏感性后，针对性投放合理的酶处理体系可以避免酶无效投放。

5.3 LiP与生物饲料

中国秸秆资源丰富，但没能得到充分利用，木质素降解菌或者酶处理秸秆后转化为生物饲料，既能提高秸秆利用率，又解决了牧区牛羊粗饲料短缺、人畜争粮争地的问题。

秸秆中高含量的木质纤维素成分难以被动物消化，且影响饲料适口性。微生物发酵后的秸秆中木质纤维素被降解成易于吸收的含糖物质，既提高了适口性，又提高了营养价值。实际应用中，单一菌种底物谱有限，酶活普遍较低，不能满足降解需求，而多菌种混合发酵可以提供较为完整的木质纤维素酶体系，提高降解效率，降低时间成本，提高微生物对大规模应用的适用性[30]。粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)含有丰富的纤维素降解基因，表达数种纤维素降解酶，能够有效降解纤维素[31]。崔周磊[32]将MnP基因克隆于食品安全级粟酒裂殖酵母中，工程菌协同粗糙脉孢菌等发酵菌种制备秸秆生物饲料，与单菌种发酵相比，混菌发酵过程中菌酶协同作用转化了菌种之间对碳源的竞争，提高了发酵的效率和品质。除食品级粟酒裂殖酵母外，木质素降解酶在饲用菌种如枯草芽孢杆菌中克隆表达有助于推进秸秆等农业废弃物饲料化。

6 总结与展望

LiP具有强大应用潜力，但无法大规模应用，根本原因是产酶菌生长缓慢、产酶量低，以及酶本身性质限制，因此，LiP的克隆表达应围绕受体菌、表达量、酶学性质3个方面。对工程菌质量的综合评估，应以应用目的为基准，如在生物饲料行业中，LiP的安全性至关重要，LiP的克隆宿主应选择无抗，生物安全且可用于饲料的菌种，在此基础上进一步优化产酶量及酶学性质；在环境治理中，普遍认为真菌抗逆性优于细菌，因此，受体菌应优先选择真菌，受体菌中酶活力也不是评估工程菌质量的唯一标准，酶的适用性和酶活力共同决定酶的应用价值。此外，如何使LiP高效应用是研究的另一个重点。小分子介质被认为能够拓宽酶底物范围，提升酶活力，目前对LiP-介质系统的研究落后于MnP和Lac，且相关研究多为ABTS、HBT、HAA等介质，这类介质价格昂贵，不适合大规模工业化应用，理想介质应该高效提升酶活，且不会给环境带来污染，同时廉价、易于获取且高效，因此，还需进一步筛选优质LiP介质。酶与酶之间协同作用已经被证实[24]，除木质素降解酶之间的协同外，构建作用范围广且高效的完整酶系可大大提升LiP的应用价值。