张涤娟，阮 健，胡卫华

（皖南医学院弋矶山医院生殖医学中心，安徽 芜湖 241000）

目前，不孕不育问题影响着8%～15%的育龄期夫妇。越来越多的不孕症患者选择实施体外受精-胚胎移植。男方的年龄及精子的总数、活动能力、形态及DNA的完整性可影响不孕症患者实施体外受精-胚胎移植的效果。在对不孕症患者进行体外受精-胚胎移植的过程中，密度梯度离心法和上游法是两种处理精液的常用方法。精子的质量可影响胚胎的质量和胚胎的结局。在使用密度梯度离心法处理精液时，可以通过不连续的密度梯度从死精子、白细胞和精浆等复杂成分中分离出高质量的精子。同时，健康的精子会暴露在离心的应激环境中，可能会导致精子的DNA受损。与密度梯度离心法相比，上游法是更为适合的处理精液的方法[1]。近年来，随着辅助生殖技术的不断进步，精液处理方法也在不断更新，每种精液处理方法各有优缺点。如果能综合这些处理方法的优点，准确地筛选出优势精子，有利于后续精子与卵子相结合，进而可培养出更多的优质胚胎。近年来，我中心应用先密度梯度离心后上游法常规处理精液，明显改善了胚胎结局。本次研究主要比较用密度梯度离心法、上游法、先密度梯度离心后上游法处理精液对体外受精-胚胎移植后胚胎结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象是2017年1月至2019年9月期间在我院生殖中心实施体外受精-胚胎移植的172例不孕症患者。在这些患者中，采用密度梯度离心法处理男方精液的患者有33例（A组），采用上游法处理男方精液的患者有74例（B组），采用先密度梯度离心后上游法处理男方精液的患者有65例（C组）。本次研究对象的纳入标准是：1）年龄＜35岁；2）体内基础性激素的水平处于正常范围内；3）发生不孕症的原因为存在输卵管因素；4）配偶进行精液常规检查的结果基本正常。三组患者的年龄、不孕年限、体质量指数（BMI）、基础性激素水平、获卵数、MⅡ卵子数等一般资料相比，P＞0.05，具有可比性。详见表1。

表1 三组患者一般资料的比较（± s ）

表1 三组患者一般资料的比较（± s ）

组别 年龄（岁） 不孕年限（年）BMI 血清促卵泡生成激素（ FSH）（mIU/mL）血清黄体生成素（LH）（mIU/mL）血清雌二醇（ E2）（pg/mL） 获卵数（个） M Ⅱ卵数（个）A组（n=33）28.70±3.386 3.58±2.702 22.21±3.246 4.60±2.255 2.90±1.806 42.19±21.046 15.64±8.362 13.30±7.269 B组（n=74）29.54±3.062 3.29±2.755 22.42±2.740 4.73±2.754 3.27±3.222 45.41±35.672 17.51±10.340 14.60±8.698 C组（n=65）28.66±2.922 3.52±1.483 21.77±1.982 4.34±2.532 2.34±2.289 48.61±19.625 17.86±9.729 14.92±8.184 t值 1.678 2.882 1.139 0.366 2.089 0.607 0.604 0.438 P值 0.190 0.059 0.323 0.694 0.127 0.546 0.548 0.646

1.2 研究方法

1.2.1 精液标本收集方法 男方禁欲2～7 d。在女方取卵的当日，男方手淫取精。用塑料取精杯收集精液。将装有精液样本的塑料取精杯放到36℃的培养箱内进行液化处理。

1.2.2 精子制备方法 1）用密度梯度离心法处理A组患者配偶的精液样本，方法是：在尖底离心管的下层加入2.0 mL浓度为80%的密度梯度分离液，在尖底离心管的上层加入2.0 mL浓度为40%的密度梯度分离液。将液化的2 mL精液样本缓慢地加入到梯度液的上方，离心处理20 min，离心机的转速为1500 r/min。弃去精液和两层密度梯度分离液。吸出沉淀物后，加入2 mL的洗精液，离心处理8 min后，弃去上清液。重复洗精1次，留取沉淀物，加入0.5 mL的受精液。检测离心后精子的活力和密度，放到室温的环境下备用。2）用上游法处理B组患者配偶的精液样本，方法是：按照1:1的比例加入液化的精液和Quinn's1020培养基。离心管倾斜45°，用上游法处理30 min。转移上层液体，离心处理8 min，弃去上清液。加入0.5 mL的受精液，混匀，记录上游处理后精子的活力和密度，放到室温的环境下备用。3）采用先密度梯度离心后上游法处理C组患者配偶的精液样本，方法是：采用密度梯度离心法对精液进行处理后，洗涤精液，弃去上清液。在沉淀物中加入1 mL的受精液。采用上游法处理约15 min，吸取上清液，调精，以备用。

1.2.3 授精及去颗粒细胞方法 采用集中受精法处理精液。卵子体外培养2～6 h后，按精卵比例为10000～20000:1受精。在加精4～6 h后去颗粒细胞，在镜下可以清楚地观察到卵子的情况。若透明带间隙内有两个极体，表示MⅡ卵成功受精。若透明带间隙内有一个极体，表示卵子为成熟的MⅡ卵，但未成功受精。若透明带间隙内无极体，表示卵子为未成熟的卵子。将受精卵转移至卵裂培养皿中。去颗粒细胞后，若受精率＜30%，患者签署《知情同意书》后，进行早期补救卵胞质内单精子注射治疗。

1.2.4 胚胎培养和囊胚培养的方法 使用Peter胚胎评分标准对胚胎的形态进行分级，使用Gardner评分标准对囊胚进行评级。

1.3 观察指标

统计三组患者卵子的正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、MⅡ卵受精率、卵子补救率和胚胎滞育率。卵子的正常受精率=D1出现2PN卵子数/加精卵子的总数×100%。正常卵裂率=卵裂胚胎数/受精卵总数×100%。优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%。可利用胚胎率=可利用胚胎数/卵裂胚胎数×100%。囊胚形成率=(D5＋D6）囊胚总数/行囊胚培养的卵裂期胚胎总数×100%。MⅡ卵受精率=受精卵子的总数/MⅡ卵子的总数×100%。卵子补救率=补救周期数/总周期数×100%。胚胎滞育率=滞育胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%。

1.4 统计学方法

使用SPSS19.0统计软件分析本次研究中的所有数据。计量资料各变量经检验不符合正态性分布或方差齐性，差异采用非参数检验。计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

三组患者卵子的正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率相比，P＞0.05。C组患者的MⅡ卵受精率高于A组患者和B组患者，P＜0.05；其卵子补救率、胚胎滞育率均低于A组患者和B组患者，P＜0.05。详见表2。

表2 三组患者胚胎结局的比较[%（个/个）]

3 讨论

目前，在辅助生殖技术领域中制备精液的方法有很多。这些方法均旨在选择高质量的精子，以确保实施体外受精-胚胎移植的质量[2]。处理精液的方法主要包括密度梯度离心法和上游法。将这两种方法结合使用，可筛选出更多有活力的优质精子。研究表明，机械性离心处理操作对精子的功能有很大的影响。在对精液进行离心处理的过程中，由脂质过氧化引起活性氧的形成可能会对线粒体造成损伤，从而可导致精子受损。采用密度梯度离心法处理的精子回收率较高，可去除精液中的抗精子抗体、白细胞等不利于受精的成分，可得到更多高质量的精子。采用上游法筛选出的精子活动率较高，但精子的回收率较低。此法适用于精液正常的患者。在畸形精子病例中，虽然采用密度梯度离心法和上游法都可以改善患者精子的质量，但采用密度梯度离心法可以获得更多形态正常、DNA完整的精子。目前，没有一项技术能够同时满足这些要求。联用密度梯度离心法和上游法处理精液，既可以保证可供受精精子的数量，又可以提高可供受精精子的质量。密度梯度离心法的多次离心处理可以彻底去除精液中不利于受精的成分。上游法则可以降低精子的畸形率。联用两种方法得到的精子更易与卵子在体外受精成功[3]。

本次研究的结果证实，在对不孕症患者实施体外受精-胚胎移植期间，与用密度梯度离心法、上游法处理男方精液相比，用先密度梯度离心后上游法处理男方精液，不但可以明显提高不孕症患者MⅡ卵的受精率，还可以增加其优质胚胎的数量，降低其卵子补救率和胚胎滞育率。