李宗明, 张全会, 韩新巍, 焦德超, 任克伟, 路慧彬

自1891年Bond用一根T形塑料管治疗气管狭窄获得了成功以来，气道支架在气道狭窄治疗方面取得了长足进步，尤其是在恶性气道狭窄治疗方面已被临床公认为是一种快速有效的急救手段。目前临床上常用支架主要有镍钛记忆合金支架和硅酮支架，在良性气道狭窄治疗方面暴露出了局限性，支架磨损气道粘膜导致炎性修复，肉芽组织过度增生导致气道再狭窄，严重影响支架治疗效果。

有学者[1,2]尝试气管镜下于肉芽组织增生处局部多点单次注射抗增殖药物，也有学者[3,4]尝试在支架表面涂抹抗增殖药物，但由于药量小，释放快，作用时间短，没能有效抑制肉芽组织的增生。本课题首先制作气管狭窄动物模型，尝试在气管支架表面涂抹缓慢降解的药物涂层，逐渐释放抗增殖药物，起到长时间抑制肉芽组织增生的效果。

材料与方法

1.对象

选用2.5～3.0 kg新西兰大耳白兔36只，雌雄不限，分成对照组(n=18只)，置入普通镍钛合金裸支架，实验组(n=18只)，置入西罗莫司涂层镍钛合金裸支架；每组内根据处死时间分为1个月组、2个月组和3个月组，各6只。

2.方法

气管狭窄动物模型建立:0.5 mL速眠新肌肉注射麻醉，将实验兔固定在实验台上，备皮、消毒、铺巾，逐层切开皮肤、皮下肌肉，暴露出颈部气管，气管软骨环间切开气管约1 cm，通过切口送入毛刷(图1a)于切口下1 cm环形破坏气管粘膜(图1b)，缝合气管切口，并逐层缝合皮下组织和皮肤，消毒包扎。术后3d内耳缘静脉注射美洛西林注射液。1个月后复查胸部CT(图1c)，建立兔气管狭窄动物模型。

图1 a) 用于破坏气管粘膜的毛刷； b) 气管环间切开气管，毛刷破坏气管粘膜； c) 胸部CT扫描气道重建显示气管中部狭窄(箭)。 图2 a) 导管进入右下叶支气管内； b) 沿导丝送入支架及其输送系统； c) 准确定位支架于气管狭窄处，释放支架。 图3 支架涂层后扫描电镜扫描。a) 支架金属丝表面浸涂均匀药膜； b) 支架折叠再展开后支架金属丝表面药物部分脱落； c) 支架金属丝交汇处药膜不均匀(箭)。

药物涂层支架制备:实验仪器及器械：电热鼓风干燥箱、电子天平、超声波清洗器、恒温孵箱、红外光谱仪、扫描电子显微镜。

试剂：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)(75:25，Mr=10000)、西罗莫司原料药、甲醇、二氯甲烷。

支架：镍钛合金裸支架，管状， 8 mm×20 mm型号。支架清洗：将镍钛合金支架置入于有机溶剂二氯甲烷中浸泡2h后取出，置于通风橱内2h，待二氯甲烷完全挥发后将支架置于超声波清洗器中清洗20 min去除支架表面杂质，烤箱中50°C烤干备用。

制备药物涂层支架：配制西罗莫司与PLGA质量比1:10的浸涂液，以二氯甲烷为溶剂配制2.5%PLGA溶液13 mL，精确称量西罗莫司，以甲醇为溶剂配制西罗莫司的甲醇溶液7 mL，之后将两种溶液混合。将清洗过的镍钛合金支架置于溶液中浸涂20 min，然后将支架置于40℃烤箱中烘烤4h使溶剂充分挥发，按上述操作再次浸涂20 min后取出烘干，将支架压入支架输送器后环氧乙烷消毒备用。

红外光谱仪检测：配制PLGA-西罗莫司浸涂液，使溶剂挥发后制成PLGA-西罗莫司药膜样本。利用红外光谱仪分别检测西罗莫司，PLGA及PLGA-西罗莫司药膜样本，通过检测PLGA与西罗莫司是否在支架制备过程中发生化学反应。

扫描电镜观察：取制备好的气管药物涂层支架及从输送器中推送出的药物涂层支架各一个，常规喷金后行扫描电镜检测，观察支架表面涂层情况。

3.涂层支架药物的体外缓释实验

实验仪器：Agilent1200 高效液相色谱仪、1200 DAD 检测器、电子天平(梅特勒，Newclassic)、KH-250B 超声波清洗器、ST16R 低温离心机。

试剂：二水合磷酸二氢钠(北京化工厂，批号20100512，分析纯)、十二水合磷酸氢二钠(北京化工厂，批号20170106，分析纯)、甲醇(北京百灵威科技有限公司，批号L170T96，色谱纯)、乙腈(上海霍启书尔贸易有限公司，批号Q70A1H，色谱纯)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(北京百灵威科技有限公司，批号LM70T82，纯度：98.5%)。

萃取液：① 0.01M PBS 溶液：准确称取 NaH2PO4·12H2O 0.441 g、Na 2 HPO4·2 H2O 1.368 g，加入1 L水溶解；②0.02% BHT乙腈溶液：精密称取BHT 100 mg至500 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容，混匀；③取0.01M PBS溶液650 mL和0.02% BHT乙腈溶液350 mL摇匀，即得萃取液。

支架处理：将药物涂层支架至10 mL棕色瓶中，加适量支架萃取液覆盖支架，超声(240W)20 min取样，用萃取液定容至刻度，混匀，取适量提取溶液转移至离心管中，23755 g离心10 min，取上清液200 μL至进样衬管中。

质控溶液：取精密称取9.93 mg至100 mL棕色量瓶中，加入萃取液溶解后稀释至刻度，混匀。精密量取上述溶液1 mL至10 mL量瓶，萃取液稀释至刻度(10，萃取液稀释)；精密量取上述溶液5～10 mL量瓶中，萃取液稀释至刻度(5瓶中/mL)，精密量取5，精密量取液溶液3～10 mL量瓶中，萃取液稀释至刻度(1.5，萃/mL)。将10将，萃取液稀、50将，萃取液、1.5，萃取液稀释对照品溶液滤过，取滤液至棕色液相小瓶。样品测定：将上述药物支架预处理液及质控溶液进样色谱纯法分析。

图4 雷帕霉素涂层支架释放液测定标准曲线。

图5 a) 单纯镍钛合金支架组气管粘膜内大量纤维素增生，胶原蛋白沉积，伴有大量炎性细胞浸润(HE，×40)； b) 药物涂层支架置入后1个月，实验兔支架上缘气道粘膜标本光镜检查显示少量纤维素增生，伴有炎性细胞浸润(HE，×40)。

4.支架置入

肌肉注射速眠新0.5 mL麻醉气管狭窄的动物模型。将实验兔固定于DSA检查床上，头偏向右侧，置入开口器，通过口腔送入5F单弯造影导管和0.035 inch亲水膜导丝，两者配合经口腔，咽喉部进入气管，并越过气管狭窄处进入一侧主支气管(图2a)，退出导管，沿导丝送入气管支架及其输送系统(图2b)，准确定位支架于狭窄处，释放支架(图2c)，退出支架输送系统，给予肌肉注射麻醉苏醒剂鹿醒宁0.5 mL。

5.实验兔的处死及标本留取

对照组和实验组分别于支架置入后1个月、2个月和3个月复查胸部CT后处死相应组别的实验兔，观察肉芽组织增生情况，并于支架上缘和下缘处取气管粘膜行HE染色病理检查。

6.统计分析

采用SPSS 21.0软件进行数据的统计学分析。组间单因素比较采用t检验，检验水准定位α=0.05，以P<0.05有统计学意义。

结 果

1.气管狭窄动脉制备

在制作气管狭窄模型过程中1只(1/36)死于麻醉过深，2只(2/36)在模型制作后3d左右因严重气管粘膜充血水肿死亡，其余33只(33/36)气管狭窄模型制作成功，补做33只均成功，狭窄程度50%～85%。

2.药物涂层支架制备

扫描电镜扫描发现支架折叠及展开后PLGA-西罗莫司药膜有部分脱落，支架金属交汇处药膜涂层不均匀(图3)。药膜制备过程中药物和载体没有发生化学反应。

支架涂层前后称重：药物涂层前对支架进行超声波清洗称重，西罗莫司涂层后再次进行称重，发现支架平均增重约0.37 mg(表1)。

表1 镍钛合金支架(8mm×20mm)载药情况

3.涂层支架药物体外缓释情况

利用建立的方法测定了9个支架在240W超声20 min条件下释放情况，结果显示雷帕霉素涂层支架体外释放良好，能够实现缓慢释放，防止排异反应的目的(表2、图4)。

表2 在体外释放条件下释放液中雷帕霉素含量

4.气管支架置入

所有气管狭窄模型均一次性成功置入气管支架，支架置入术中及术后未出现窒息、出血、气管穿孔等并发症。

5.支架置入后气管再狭窄

两组气管支架处均有不同程度的肉芽组织增生，以支架上缘为著。在3个实验节点时，实验组气管狭窄程度均轻于对照组且差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 镍钛合金支架和药物涂层支架置入后气道再狭窄的程度

6.支架置入后气管粘膜改变两组实验兔处死后分别于支架上下缘处取气管粘膜，HE染色后观察发现单纯镍钛合金支架组气管粘膜内大量纤维素增生，胶原蛋白沉积，伴有大量炎性细胞浸润(图5a)。而西罗莫司涂层支架组纤维素增生，胶原蛋白沉积明显减少(图5b)。

讨 论

1891年Bong[5]首次采用气管切开后置入T管方法治疗声门下气管狭窄。Montgomery[6]1965年发明了T型管气管支架。Dumon[7]1987年发明Dumon硅酮支架，硅酮支架大大提高了支架生物相容性，但是置入困难，需要全麻下借助硬质支气管镜才能完成，硅酮支架管壁较厚，占据了较大的气管内空间，而且支架移位和痰液储留发生率较高。1989年Simonds[8]发明了镍钛合金自膨式气管支架，具有形状记忆特性，且支架移位和痰液储留发生率较低，一直沿用至今，并且衍生出许多不同形状气道支架用于满足临床需求。但是由于支架置入后气道粘膜肉芽组织增生导致气道再狭窄等问题长期困扰着临床医生[9]。

国内外学者尝试在支架表面添加抗增殖药物。Choong等[10]在气道支架表面涂覆丝裂霉素(mitomycin，MMC)，并且进行了相关动物实验发现MMC涂层可以减轻气道支架置入后肉芽组织增生且作用大小和MMC的剂量呈正相关。Choong等[11]又首次报道了紫杉醇涂层气道支架动物实验结果显示支架置入后1周、1个月、2个月和3个月时，实验组(置入紫杉醇涂层气道支架)气道通畅率为100%、96%、76%和65%，而对照组(置入未载药气道支架)气道通畅率分别为10%、0%、0%和0%。Shin等[12]发明激素涂层支架(地塞米松-聚胺酯气道支架)，研究发现地塞米松涂层支架可有效抑制肉芽组织增生。

本研究首先采用西罗莫司涂层，西罗莫司是一种大环内脂类抗生素，属于细胞增殖抑制剂，可有效抑制细胞增殖且没有明显细胞毒性。选用PLGA为载体，通过PLGA的缓慢释放达到药物缓释的效果。通过红外光谱仪检测发现PLGA和西罗莫司在制备浸涂液时没有发生化学反应，扫描电镜检测发现浸涂液可均匀的涂覆在支架金属丝表面。实验兔气道狭窄动物模型真实的还原了气管狭窄的病理生理环境。将未载药的镍钛合金裸支架和PLGA载西罗莫司涂层气道支架分别置入气管狭窄模型兔气管内发现药物涂层支架组气道再狭窄的程度明显轻于单纯支架组。

本研究结果证明PLGA载载西罗莫司涂层气道支架可有效抑制气道支架置入后气道粘膜肉芽组织增生，降低气道再狭窄程度。但仍存在一些不足，包括载药量较低、无法多次给药以及药物释放速度和规律不明确等问题，需进一步研究。