丁凯景 丁雨钦 周圆月 刘艳 简凤清 廖文静 童海静 孙玉燕 李艳萍 周国岭

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是一种神经发育障碍，我国儿童青少年的患病率为6.26%[1]。ADHD的核心症状为注意力不集中、多动和（或）冲动[2]，对患者教育、工作、生活等多项个人发展问题影响深远，给家庭、社会造成负担，是一个重要的公共卫生问题。ADHD的病因和发病机制至今尚未完全明了，许多研究提示ADHD有家族聚集性，大量的家系、寄养子、双生子及新近分子水平的研究均提示遗传因素是ADHD的发病机制之一[3-4]。但目前尚未发现与这种疾病直接相关的特异性基因，具体的遗传模式也尚未阐明。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中含量最丰富的一种氨基酸类兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节[5]。N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）是离子型谷氨酸受体的一个亚型，不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而且对神经元回路的形成亦起着关键的作用，研究表明NMDAR是学习和记忆过程中一类至关重要的受体[6]。本研究选取了NMDAR亚基NMDA2A基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，GRIN2A）和NMDA2B基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B，GRIN2B）的2个单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphisms，SNPs）进行研究，探讨其基因多态性与ADHD之间的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016年2月至2018年4月就诊于浙江大学医学院附属精神卫生中心（杭州市第七人民医院）儿童心理科ADHD患儿49例（ADHD组），其中男36 例、女 13 例，年龄 6～15（8.55±2.88）岁，ADHD 由 2 名主治级别以上的精神科医师按照美国精神疾病诊断统计手册第五版（the diagnostic and statistical manual of mental disorders fifth edition，DSM-5）为诊断标准共同确诊。选择同时期我院健康体检儿童50例作为健康对照组，其中男 30 例，女 20 例，年龄 6～15（8.80±2.49）岁。排除标准：（1）智商＜70分；（2）自闭症谱系障碍、抽动秽语综合征及其他神经发育障碍；（3）目前或既往符合精神分裂症、情绪障碍及其他精神心理疾病；（4）癫痫及其他重大躯体疾病。两组对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究均征得患儿本人知情同意，并由监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 ADHD症状评定及神经心理测评 采用以下ADHD症状评定量表和神经心理测评，对患儿进行认知功能、行为表现、注意力水平的系统评价。（1）儿童注意力量表（Swanson，Nolan，and Pelham version Ⅳ scale，SNAP-Ⅳ）：采用26条目量表，内容包含注意缺陷分量表（第1～9题）、多动冲动分量表（第 10～18题）、对立违抗分量表（第19～26题），由患儿父母填写，用以评估ADHD患者的严重程度并进行亚型分类[7]。（2）中国韦氏儿童智力量表（Chinese Wechsler intelligence scale for children，C-WISC）：由心理测量技师实施，用以评价儿童智力水平。（3）Conners父母评症状量表（conners parent symptom questionnaire，PSQ）：采用 48 条目量表，包含冲动多动、品行问题、多动指数、学习问题、心身障碍和焦虑6个因子，由患儿父母填写，筛查儿童行为问题。（4）注意力竞量测验（the test of variables of attention，T.O.V.A.）：其为一种持续性操作测验，包含理解力商数、控制力商数、注意力商数、多动商数值等指标，用以评价ADHD患儿的操作水平。

1.2.2 基因检测 两组对象均抽取外周静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管-20℃冰箱保存，抽提样本DNA（北京天根生化科技有限公司，血液基因组DNA提取试剂盒），采用紫外分光光度法进行DNA浓纯度测定后保存于-80℃冰箱备用。根据美国国立生物信息情报中心检索dbSNP数据库（datebase of single nuleotide polymorphisms，dbSNP）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）以及既往文献[8-9]，选取GRIN2A rs2229193和GRIN2B rs2284411作为候选基因位点，设计扩增引物（GRIN2B基因：5′-ACGTTGGATGATGACATCATCAGTGTCTGC-3′and 5′-ACGTTGGATGCATGACTTTTTTCCCCTACTC-3，GRIN2A基因：5′-ACGTTGGATGTTGACGAACTTCCGACATGG-3′and 5′-ACGTTGGATGCGTCATCGTGGAAGACA TAG-3′）。使用SNP基因分型试剂盒（美国，Applied Biosystems公司，40×TaqManSNP Genotyping Assay Mix）及万能 PCR液（大连宝生物工程有限公司，Premix Ex TaqTM），在ABI 7300实时荧光定量 PCR仪（美国，Applied Biosystems公司）上进行实验操作，PCR循环参数：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、40个循环。扩增反应完成后，读取反应后的荧光数据，利用内置软件进行等位基因分型。采用PCR凝胶电泳检测扩增产物，并随机选取两个样本测序验证多态性与实验室数据一致性。

1.2.3 观察指标 比较两组GRIN2A基因型频率G/G和G/A，GRIN2B基因型频率C/C和（T/C+T/T）的分布差异。结合ADHD症状评定量表和神经心理测评得分，比较GRIN2A、GRIN2B不同基因型ADHD患儿的症状。

1.3 统计学处理 结合临床数据、实验室数据进行统计分析。采用SPSS 24.0统计软件，所有数据经Epidata 3.0软件二次录入并核对。采用Haploview软件进行候选基因多态位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验和连锁不平衡分析。符合正态分布的计量资料以表示，比较采用t检验。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 两组各SNPs基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律（P＞0.05）。样本有群体代表性，基因频率能代表群体的基因分布。

2.2 两组儿童GRIN2A、GRIN2B基因型频率比较 见表 1、2。

表1 两组儿童GRIN2A基因型频率比较

由表1可见，两组儿童GRIN2A基因型频率（G/G比较G/A）分布比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

由表2可见，两组儿童GRIN2B基因型频率C/C和（T/C+T/T）分布比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 两组儿童GRIN2B基因型频率比较

2.3 GRIN2A、GRIN2B两种不同基因型ADHD患儿的症状比较 见表3、4。

由表3、4可见，GRIN2A为G/A+A/A基因型的患儿较G/G基因型的患儿有更高的SNAP-Ⅳ对立违抗分量表得分，以及更高的PSQ品行问题得分，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两种基因型患儿在SNAP-Ⅳ其他分量表分、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。GRIN2B为C/C基因型和T/C+T/T基因型的两种患儿 SNAP-IV、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表3 GRIN2A两种不同基因型ADHD患儿的症状比较（分）

表4 GRIN2B两种不同基因型ADHD患儿的症状比较（分）

3 讨论

谷氨酸参与调节神经元的存活，调节神经元的树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等[6]。Spencer等[10]在对50个应用磁共振光谱学技术的荟萃分析中发现，ADHD患儿颅内尤其前扣带皮层中谷氨酸代谢增加。在ADHD大鼠模型中，研究者也发现，前额叶纹状体脑组织中发生谷氨酸代谢水平紊乱[11]。Park等[12]还发现谷氨酸代谢型受体亚型7（mGluR7）基因（GRM7）rs37952452的G/A基因型相较G/G基因型在哌醋甲酯治疗中有更明显的反应速度，可能在儿童多动症治疗响应哌甲酯发挥作用。谷氨酸受体基因在精神疾病中起着重要作用，并且可能与ADHD的症状表现或药物响应相关[13]。

Dorval等[14]对GRIN2B的9个SNPs位点进行检验，发现其中3处单核苷酸多态性（其中以rs2284411尤为显著）显示了显著的传递不平衡，且与ADHD的注意力缺陷、冲动多动症状均有关联，但与认知水平、口头的短时记忆或言语工作记忆无关。Turic等[15]发现GRIN2A的5号外显子遗传变异与ADHD的发病风险增加相关；然而Adams等[5]却并未发现GRIN2A与ADHD冲动控制、认知表型的显著关联；同样，Nyman等[16]也并未发现GRIN2A多态性与ADHD的阳性结果。高雪屏等[17]应用基因扫描技术发现GRIN2A的G1430A位点多态性与ADHD可能并无关联。Kim等[9]发现ADHD患者GRIN2B等位基因与响应时间变异性存在关联，C/C亚组的响应时间变异性高于C/T+T/T亚组；GRIN2A等位基因的G/G亚组比G/A+A/A亚组在测验中存在更多的遗漏错误。该课题组的另一项研究还发现GRIN2B基因rs2284411位点C/C基因型显示出对哌醋甲酯更好的治疗反应，GRIN2B基因C/C基因型在CPT的RTV上也显示出更大的改善，GRIN2A基因G/G基因型比G/A基因型显示出更大的CPT错分误差改善[8]。同时，kim等[18]团队的头颅MRI成像研究也发现GRIN2B等位基因与左侧上顶叶簇的静态区域同质性均值有显著的诊断和交互作用，且静态区域同质性均值与具有T等位基因亚组的多动症儿童颜色痕迹测试干扰评分呈正相关。而最近Zhang等[19]的研究则未发现GRIN2A、GRIN2B基因多态性与中国汉族人群ADHD易感性显著相关。

本研究发现GRIN2A基因中A等位基因携带患儿有更多的对立违抗行为和品行问题，提示GRIN2A基因多态性可能与ADHD共病对立违抗障碍及品行障碍相关。与既往相关研究结果的不一致性可能与不同种族人群之间等位基因差异有关。本研究样本量较少，且ADHD是多基因遗传的复杂疾病，存在多种基因交互作用，本研究局限于两个候选基因位点，该结论需进一步扩大样本量，并行更多的谷氨酸能相关基因研究验证。