赵逸清，刘政均，张田鑫，赵彦婷，肖斌，高岳芳*

茶树基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析

赵逸清1，刘政均1，张田鑫2，赵彦婷1，肖斌1，高岳芳1*

1.西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100

镁离子螯合酶是叶绿素合成过程中的关键酶之一，与植物叶色的白化现象密切相关。以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶等5个茶树品种叶片为试验材料，分别克隆其镁离子螯合酶I亚基（Mg-chelatase I subunit，CHLI）编码基因全长CDS序列。多序列比对显示，白叶1号中两个碱基差异位点（G502C，C1169T）导致在AAA+和AAA lid结构域中有2个氨基酸残基发生改变（G168R，A390V），黄金叶中1个碱基差异位点（G1202A）导致在AAA lid结构域中有1个氨基酸残基发生改变（R401H）。亚细胞定位结果显示，CsCHLI定位于叶绿体中，碱基或氨基酸残基的差异并不影响其亚细胞定位。RNA二级结构分析表明，碱基位点突变会影响的茎环结构和二级结构的稳定性。与陕茶1号相比，不同叶色白化茶树品种中总叶绿素含量分别为陕茶1号的25%～77%，基因表达量分别为陕茶1号的24%～46%。结果表明，茶树中的基因表达与叶绿素含量呈正相关。这些结果将为深入研究在茶树叶绿素代谢中的功能以及茶树叶色突变的作用机理提供试验证据。

茶树；；亚细胞定位；RNA二级结构；叶绿素含量

叶绿素（Chlorophylls）是植物进行光合作用的主要色素，叶绿素生物合成代谢中任何一个基因的突变或缺失都会使植株呈现不同程度的叶色变异。近年来，在拟南芥[1]、水稻[2]、玉米[3]、黄瓜[4]、大豆[5]等多种植物中均有叶色突变体的研究报道。通常情况下，叶色突变会使植株发育迟缓、生长势减弱、生物量和产量降低，甚至导致植株死亡。但在茶树中，不同白化程度的特异叶色突变体均具有高含量的茶氨酸和特异的外形，经济价值更高[6-8]。因此，研究茶树叶色特异突变体，在茶树叶色调控机理、叶片发育、茶树光合作用和次生代谢等研究中均有重要的理论价值。

镁离子螯合酶（Magnesium chelatase，Mg-chelatase）是叶绿素生物合成途径分支中的关键酶，在依赖ATP的条件下，催化原卟啉IX与Mg2+螯合形成镁原卟啉IX[9]。Mg-chelatase至少由3个亚基组成，分别为I亚基（ChlI）、D亚基（ChlD）和H亚基（ChlH）。I亚基定位于叶绿体中，属于AAA+（ATPases associated with various cellular activities）超家族，能够结合和水解ATP为镁离子螯合反应提供能量[10]。在拟南芥、小麦、大豆、黄瓜、水稻、银杏等物种中均有关于基因的突变导致其叶绿素合成受阻，从而呈现出白化的表型[4,11-15]。拟南芥中存在2个同源基因，任何基因的缺失均能使植株表现出黄色白化表型，而纯和的双突变体则是白化致死表型[11]。Wang等[12]研究表明，小麦中单核苷酸突变（G664A），使其叶绿素含量及其前体物质原卟啉IX和镁原卟啉IX的积累显著减少，并呈现出明显的淡绿色表型。Du等[13]研究表明，大豆基因中1个单碱基错义突变（G1709A），使Gmcd1与GmCHLI1 a/b的相互作用降低，致使叶绿素生物合成受到抑制。Gao等[4]在黄瓜EMS诱变中发现1个稳定遗传的黄叶突变体，图位克隆结果表明，是由于黄瓜基因中单核苷酸突变（G1757A）造成的。Zhang等[14]在水稻的研究中发现，由于单碱基突变（G529C）造成AAA+结构域中氨基酸残基改变（G177R），致使OsCHLI不能与OsCHLD互作，从而引发表型白化。上述研究结果均表明，在不同物种中，镁离子螯合酶I亚基在叶绿素生物合成中均是必不可少的，但目前茶树中尚未见基因的研究和报道。

本研究以绿色茶树品种陕茶1号，白化白色系茶树品种白叶1号和极白1号，白化黄色系茶树品种黄金芽和黄金叶为材料，分别克隆了这5个品种中的全长编码序列（Coding sequence，CDS），对它们的碱基序列差异、编码氨基酸的理化性质和保守结构域进行分析，构建不同物种中CHLI的进化树，分析其亲缘和进化关系；同时，研究了它们的亚细胞定位、RNA二级结构，并分析了叶绿素含量与基因表达量的关系，以期为深入研究在茶树叶色突变中的功能和作用机制提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为绿色茶树品种陕茶1号，白化白色系茶树品种白叶1号和极白1号，白化黄色系茶树品种黄金芽和黄金叶的两年生扦插盆栽茶苗，种植于西北农林科技大学科研温室，培养条件为白天25℃，晚上22℃，自然光照。于2019年9月15日，分别取芽下第一叶，液氮冷冻，置于–80℃冰箱保存，用于RNA提取和叶绿素含量测定。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成

采用CTAB法提取茶树叶片的总RNA[16]，使用Nanodrop ND 2000（Thermo Scientific，美国）微量紫外分光光度计检测总RNA浓度，利用1.2%凝胶电泳检测RNA完整性。按照5×All-In-One RT Master Mix（ABM生物科技有限公司，加拿大）试剂盒，将总RNA反转录为cDNA，置于–20℃冰箱保存备用。

1.2.2基因克隆

依据安徽农业大学茶树基因组数据（http://tpia.teaplant.org）[17]中CsCHLI的编码序列TEA018733.1，根据序列特征在开放阅读框两端设计特异引物（5'-CCAACTAGTGGTAAATACCTCGTAAAATTTCTCA-3'）和（5'-CGTCCATGGCCAGTGTTCTCGGAA-3'）。PCR扩增体系为40 μL，包括2×Phanta Max Master Mix酶20 μL，ddH2O 15 µL，模板cDNA 1 µL以及引物与各2 µL。反应条件为预变性95℃3 min；循环反应95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用PCR纯化试剂盒（OMEGA，美国）回收目的片段。目的片段和植物表达载体3302Y（实验室自备）分别经NcoI和SpeI限制性内切酶（TAKARA，大连）双酶切，用T4连接酶（TAKARA，大连）连接至3302Y载体上，后转化至大肠杆菌，挑取阳性单克隆送生工生物工程股份有限公司（上海）测序。

1.2.3 CsCHLI生物信息学分析

利用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对CsCHLI进行保守结构域分析。在NCBI网站下载24个物种的CHLI全长蛋白质序列，采用Geneious 9.0软件进行多序列比对与进化树的构建。采用在线工具ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）进行氨基酸组成及理化性质分析。采用在线工具TargetP-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）进行信号肽分析和亚细胞定位预测。采用在线工具The mfold Web Server （http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）进行5个茶树品种的RNA二级结构预测。

1.2.4 CsCHLI亚细胞定位

将去除终止密码子的连接到带有EYFP的3302Y植物表达载体上，构建融合表达载体35 S::CsCHLI::EYFP。以空白载体35S::EYFP为阴性对照，采用热激法将空白载体与融合表达载体分别转化至根癌农杆菌GV3101中。将转化后GV3101菌液培养至适宜浓度（OD值1.0），3 500 r·min-1离心5 min，收集菌体，用重悬液（0.5 mol·L-1MES 200 µL，1 mol·L-1MgCl2100 µL，100 mmol·L-1乙酰丁香酮10 µL，ddH2O定容至10 mL）重悬菌体至OD值0.6～0.8，重悬菌液避光3 h后，采用无针头的一次性无菌注射器将菌液从下表皮缓慢注射入本氏烟草叶片中，培养48 h后，利用激光共聚焦显微镜（Leica，德国）观察、拍照，并记录结果。

1.2.5 叶绿素含量测定

参照向芬等[18]叶绿素测定方法，用95%乙醇提取茶树叶片叶绿素，分别测定提取液在波长665 nm与649 nm下的吸光值。使用Wellburn等[19]的公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量，每个样品进行3次生物学重复。采用SAS软件进行数理统计与方差分析，利用Prism 8绘制图表，试验数值以3次重复的平均值±标准差（Mean±SD）表示。

1.2.6基因表达量分析

2 结果与分析

2.1 不同叶色白化茶树CsCHLI基因克隆

为探究在不同叶色白化茶树品种中其碱基序列是否存在差异，分别以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶cDNA为模板，使用特异引物和进行PCR扩增，结果如图1-A所示。将目的片段纯化、酶切并连接至3302Y载体中，选取阳性单克隆测序，获得各茶树品种的CDS序列。测序结果表明，陕茶1号、白叶1号和极白1号的的CDS序列长度均为1 275 bp，编码424个氨基酸；与陕茶1号的CDS序列相比，黄金芽的碱基序列发生6个碱基的缺失，CDS长度为1 269 bp，编码422个氨基酸；黄金叶的全长CDS序列发生3个碱基的插入，长度1 278 bp，编码425个氨基酸。此外，5个不同叶色茶树品种的全长CDS序列存在多处碱基差异（图1-B）。

2.2 茶树CsCHLI氨基酸序列比对

大多数基因最终是以蛋白质的形式行使功能，为探究不同叶色茶树品种基因中其碱基序列的差异是否会对其蛋白质序列造成影响。采用ExPASy对不同叶色茶树CsCHLI的CDS序列进行翻译，并利用Geneious 9.0软件对各CsCHLI氨基酸序列和安徽农业大学舒茶早CsCHLI（TEA018733.1）编码的蛋白质序列进行多序列比对。结果如图2所示，氨基酸序列分析显示1—64为叶绿体转运肽，95—291属于AAA+结构域（Pssm-ID 99707）和351—419属于AAA lid结构域（Pssm-ID 380038）。P18S与Q28H两个残基差异位点只在陕茶1号中存在，属于陕茶1号与其他品种的差异。除此之外，与陕茶1号相比，在功能结构域中，不同叶色白化茶树品种中CsCHLI氨基酸残基差异分别为白叶1号2个位点（G168R和A390V），分别属于AAA+结构域和AAA lid结构域、黄金芽2个氨基酸残基缺失（YG43-44）、黄金叶1个位点（R401H）属于AAA lid结构域，以及1个氨基酸残基插入（17 S）。

2.3 CHLI蛋白质的理化性质分析

为进一步分析CHLI蛋白质的功能，利用ExPASy-ProtParam在线工具分析对茶树、猕猴桃、咖啡、烟草、马铃薯和番茄等物种的CHLI蛋白质个数、相对分子量、组成成分和理化性质进行分析。结果如表1所示，在该6个物种中CHLI氨基酸个数为422～429，相对分子量为46.25～46.81 kDa。理论等电点为5.55～6.10，碱性氨基酸占比12.47%～12.97%，酸性氨基酸占比13.55%～14.45%，脂肪族氨基酸占比22.28%～23.00%，芳香族氨基酸占比4.26%～4.67%，总平均疏水性–0.258～–0.197。由表1可知，不同物种中CHLI蛋白质的个数和理化性质相似度很高，表明CHLI的功能在不同物种中高度保守。

注：M：DNA marker，1：陕茶1号，2：白叶1号，3：极白1号，4：黄金芽，5：黄金叶。...：相同碱基，---：缺失碱基，不同色块表明碱基差异

Note: M: DNA Marker, 1: Shaancha 1, 2: Baiye 1, 3: Jibai 1, 4: Huangjinya, 5: Huangjinye....: same bases.---: missing bases.Different color blocks indicate base difference

图1基因PCR扩增结果（A）和序列差异位点（B）

Fig.1 PCR amplifications (A) and differenct gene sequences (B) of

2.4 CHLI的进化分析

为探究茶树CsCHLI与其他物种的亲缘及进化关系，在NCBI网站中，分别从藻类、苔藓、蕨类、单子叶植物和双子叶植物中共选取24个物种的CHLI氨基酸序列与5个不同叶色的茶树CsCHLI氨基酸序列构建进化树（图3-A）。结果表明，藻类、苔藓和蕨类植物中CHLI的亲缘关系较近，分布在同一个分支中；单子叶植物水稻、高粱、小米中CHLI的亲缘关系较近；茶树CsCHLI与猕猴桃亲缘关系最近，与咖啡、烟草、马铃薯、番茄等次之。图3-B为不同物种CHLI对应的氨基酸序列，其中黑色表示该区域在不同物种中相同的氨基酸残基，灰白色则指示该区域存在氨基酸残基差异。蓝色与橙色方框分别为NCBI中显示的AAA+结构域和AAA lid结构域。从图3-B可以看出，不同物种中AAA+和AAA lid两个结构域保守性较强。

注：黑色线条指示叶绿体转运肽。蓝色方框区域指示AAA+结构域，橙色方框区域指示AAA lid结构域

Note: The black line indicates the chloroplast transit peptide.The blue box indicates the AAA+ domain, the orange box indicates the AAA lid domain

图2 茶树CsCHLI氨基酸序列比对

Fig.2 Alignment of amino acid sequences of CsCHLI in tea plants

表1 CHLI氨基酸组成成分及理化性质分析

注：蓝色方框区域指示AAA+结构域，橙色方框区域指示AAA lid结构域

Note: The blue box indicates the AAA+ domain, the orange box indicates the AAA lid domain

图3 CHLI进化树分析（A）和氨基酸序列比对（B）

Fig.3 Phylogenetic tree analysis (A) and alignment of amino acid sequences (B) of CHLI

2.5 CsCHLI亚细胞定位

用激光扫描共聚焦显微镜观察亚细胞定位（图4），以空载体35S::EYFP为对照的烟草叶片细胞中，YFP黄色荧光在细胞质和质膜上均有分布；而转化不同叶色茶树品种构建的35S::CsCHLI::EYFP融合表达载体的烟草叶片细胞中，YFP黄色荧光与叶绿体自发红色荧光重合，表明茶树CsCHLI定位在叶绿体中。此外，不同叶色茶树品种35S::CsCHLI::EYFP融合蛋白均定位在叶绿体上，表明5个不同叶色茶树品种中CsCHLI个别碱基或氨基酸残基的差异并不影响其亚细胞定位。

2.6 茶树CsCHLI RNA二级结构预测

为探究不同叶色白化茶树品种中碱基差异对RNA稳定性的影响，利用在线工具The mfold Web Server对5个茶树品种的序列进行RNA二级结构预测分析。与陕茶1号相比（图5-A），白叶1号中存在7处碱基差异，茎环结构较多，ΔG=–340.65 kkal·mol-1高于陕茶1号ΔG=–346.93 kkal·mol-1（图5-B）；极白1号中存在4处碱基差异，茎环结构较少，ΔG=–349.78 kkal·mol-1低于陕茶1号（图5-C）；黄金芽中存在4处碱基差异和1处6个碱基缺失，其碱基缺失造成茎环结构改变，ΔG=–346.13 kkal·mol-1略高于陕茶1号（图5-D）；黄金叶中存在有5处碱基差异和1处3个碱基的插入，茎环结构减少，ΔG=–353.64 kkal·mol-1低于陕茶1号（图5-E）。

2.7 不同叶色白化茶树中叶绿素含量和CsCHLI基因表达量分析

为探究不同叶色白化茶树品种中叶绿素含量和基因表达量之间的关系，分别测定其叶绿素含量并通过qRT-PCR对的基因表达量进行分析。如图6-A所示，与陕茶1号相比，不同叶色白化茶树叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量均有不同程度的降低，且存在显著性差异。其中，白叶1号叶片中叶绿素a和叶绿素b分别为陕茶1号的76%和80%；极白1号叶片中叶绿素a和叶绿素b分别为陕茶1号的44%和55%；黄金芽叶片中叶绿素a和叶绿素b分别为陕茶1号的25%和25%；黄金叶叶片中叶绿素a和叶绿素b分别为陕茶1号的31%和16%。不同叶色白化茶树中基因表达量如图6-B所示，与陕茶1号相比，白叶1号基因表达量降低了54%；极白1号基因表达量降低了76%；黄金芽基因表达量降低了67%；黄金叶基因表达量降低了57%。上述结果表明，与绿色茶树相比白化茶树中叶绿素含量和基因表达量呈正相关。

3 讨论

植物白化现象非常普遍，但是造成白化表型的分子机制十分复杂。本研究从5个茶树品种中克隆并分别获得基因的碱基序列。对它们的蛋白质理化性质进行分析可知，CsCHLI为疏水性蛋白质。亚细胞定位显示茶树CsCHLI定位于叶绿体中，与水稻和大豆等物种CHLI定位相吻合[14,22]。通过NCBI-CDD保守结构域分析可知，CsCHLI分别包含AAA+结构域和AAA lid结构域，这与I亚基属于AAA+超家族，并调节ATP的水解功能的作用相符[10]。

通过对5个茶树品种基因的克隆和蛋白质序列分析表明，不同叶色白化茶树品种中基因的碱基序列和蛋白质序列存在多个位点的差异。特别是与陕茶1号相比，黄金芽中的碱基序列发生6个碱基的缺失，黄金叶中的全长CDS序列发生3个碱基的插入，但是在黄金芽和黄金叶中发生的缺失和插入的碱基数均为3的倍数，并未对阅读框造成影响，其蛋白质序列差异不大。Zhang等[14]报道了一个水稻黄化突变体和()，该突变体是由单碱基突变（G529C）造成AAA+结构域中的氨基酸残基发生错义突变（G177R）。水稻中该位点突变并不影响亚细胞定位结果，与本研究结果一致。水稻突变体中质体转录基因（，和）和光合作用相关基因（和）显著降低，酵母双杂交表明的错义突变致使OsCHLI与OsCHLD不能互作。拟南芥中研究也表明，AtCHLD的稳定性与AtCHLI有关[11]。同时，Du等[13]报道大豆黄化突变体是由于的一个碱基发生变化（G1709A），导致AAA+结构域氨基酸残基发生错义突变（D278N），且该结构域属于N段结合结构域，从而影响Gmcd1与GmCHLI1a/b的相互作用。本研究中，白叶1号，其氨基酸序列在168和390两个位点发生氨基酸残基的改变（G168R，A390V），分别属于AAA+结构域和AAA lid结构域；黄金叶中在401位点发生氨基酸残基的改变（R401H），属于AAA lid结构域。因此白叶1号和黄金叶中保守结构域氨基酸残基的变异是否会影响茶树中CsCHLI与CsCHLD的互作，降低质体基因以及光合作用相关基因的表达量，进而导致茶树叶色出现白化表型，还需进一步功能验证。

图4 茶树CsCHLI的亚细胞定位

注：A：陕茶1号，B：白叶1号，C：极白1号，D：黄金芽，E：黄金叶，结构的自由能标注在图下方。差异位点用红色箭头指出，插入位点用黑色箭头指出，缺失位点用蓝色箭头指出

Note: A: Shaancha 1, B: Baiye 1, C: Jibai 1, D: Huangjinya, E: Huangjinye.The free energy of the structure was shown at the bottom of the picture.The difference sites were pointed out by the black arrows, and the insertion site was indicated by the black arrow, and the missing site was indicated by the blue arrow

图5 茶树的RNA二级结构

Fig.5 RNA secondary structure ofin tea plants

注：SC1：陕茶1号，BY1：白叶1号，JB1：极白1号，HJYa：黄金芽，HJYe：黄金叶。*：＜0.05；**：＜0.01

Note: SC1: Shaancha 1, BY1: Baiye 1, JB1: Jibai 1, HJYa: Huangjinya, HJYe: Huangjinye.*:＜0.05.**:＜0.01

图6 茶树叶绿素的含量（A）和表达分析（B）

Fig.6 Chlorophyll content (A) and expression analysis of(B) in tea plants

由RNA二级结构分析得知，白叶1号的稳定性低于陕茶1号，与其的基因表达量显著低于陕茶1号结果相一致，即RNA二级结构的改变导致其不稳定，在一定程度上降低了的表达（图5，图6-B）。上述结果初步表明，不同叶色中的碱基差异对其RNA二级结构的稳定性和基因表达量存在一定影响，并最终影响叶绿素的生物合成，使叶片呈现不同程度的白化现象。在拟南芥不同等位突变如（C584T）或T-DNA插入突变体中，基因表达量均有不同程度的下降，且叶片均呈现黄化或白化表型[11]。同样，吴全金[23]对白化黄色系茶树品种白鸡冠进行遮荫处理表明，随着遮荫时间延长，叶绿素含量逐渐增加，叶片由黄白色转变为绿色，基因表达量在1～3 d时显著增加，6 d时有轻微的下降。与本研究相似，对茶树叶片中叶绿素含量关联分析表明，与正常绿色茶树品种陕茶1号相比，其他4个叶色突变的茶树品种中其叶绿素含量和的表达量均有不同程度的下降，并存在显著性差异，这些结果表明，基因表达量与叶绿素含量呈正相关。

CHLI进化及保守结构域（图3）分析表明，从低等植物藻类到高等植物中均存在CHLI，且保守性较强，表明CHLI在进化过程中较保守，且是绿色生物叶绿素合成所必不可少的。此外，在不同物种中，CHLI还存在同源物，如大豆中存在4种同源物[22,24]，但是仅和在叶绿素合成中起作用；拟南芥中存在可相互替代的CHLI1与CHLI2以行使功能作用[11]，而莱茵衣藻中CHLI2不可替代CHLI1[25]。茶树中目前仅发现一个基因，但在众多的白化茶树资源中，是否存在其他的同源物，以及其在茶树叶色变异和叶绿素生物合成中的具体分子机制如何，这些都是今后研究的重点。

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Cloning ofGene and Its Expression Analysis inDifferent Albino Tea Cultivars ()

ZHAO Yiqing1, LIU Zhengjun1, ZHANG Tianxin2, ZHAO Yanting1, XIAO Bin1, GAO Yuefang1*

1.College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

Magnesium chelatase is one of the key enzymes in the process of chlorophyll synthesis, which is closely related to the albino phenomenon of leaves.In this study, the leaves of tea cultivars Shaancha 1, Baiye 1, Jibai 1, Huangjinya and Haungjinye were used as materials to clone the full-length CDS sequences of(Mg-chelatase I subunit).Multi-sequence alignment shows that the two base differences (G502C, C1169T) were found in Baiye 1, which lead to the change of two amino acid residues (G168R, A390V) in the AAA+and AAA lid domain.Meanwhile, there was an amino acid residue changed (R401H) in the AAA lid domain of Huangjinye, due to the difference of G1202A.Subcellular localization analyses illustrates that CsCHLI is localized in chloroplast and the differences of the bases or amino acid residues did not affect its subcellular localization.The RNA secondary structure analysis shows that base site mutations ofwould affect its stem-loop structure and the stability.Moreover, the chlorophyll contents in albino tea plants were 25%-77% of that in Shaancha 1, and the expressions ofin albino tea plants were 24%-46% of that in Shaancha 1.The results show that theexpression was positively correlated with chlorophyll content in tea plants.Furthermore, these results provided experimental evidences for the in-depth study of the chlorophyll metabolism in albino tea plants.

,, subcellular localization, RNA secondary structure, chlorophyll content

S571.1；Q753

A

1000-369X(2021)03-327-10

2020-07-10

2020-08-03

国家自然科学基金（31700612）、陕西省自然科学基金（2019JQ-082）、咸阳市科技计划项目（2019k01-52）

赵逸清，男，硕士研究生，主要从事茶树白化研究，zyq2019@nwafu.edu.cn。*通信作者：yuefanggao@nwafu.edu.cn

（责任编辑：赵锋）