税霖飞，郑晓娇，刘可智

中国人均酒精消费量从2005年的4.1 L增加至2016年的7.2 L[1]。反复过度饮酒导致躯体和心理健康损害及其不良的社会后果被称为酒精有害使用(HUA)[2]。睡眠障碍普遍存在于酒精使用障碍的各个阶段；在酒精使用障碍的患者中，失眠患病率为36%～91%，而普通人群失眠患病率为10%[3]。

昼夜节律基因可能参与了HUA及其所导致的一系列行为改变，如睡眠行为，甚至成瘾行为[4-5]。本研究探讨HUA对昼夜节律基因在mRNA表达以及对睡眠行为的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 HUA组：为2018年12月至2019年11月期间采用网络招募的形式招募持续性饮酒超过1个月或每年都反复使用酒精的志愿者。纳入标准：①符合《国际疾病分类》第10版(ICD-10)HUA诊断标准；②酒精使用障碍筛查量表(AUDIT)评分>7；③男性，18～65岁，右利手；④小学文化水平及以上，能完成量表评估、整夜睡眠监测及抽血检查；⑤对本研究知情同意，签署知情同意书。排除标准：①其他精神活性物质使用史(吸烟或精神科医师处方中精二药品使用史除外)；②合并严重的躯体疾病；③合并其他精神障碍。终止标准：①被试有权随时提出终止试验的要求；②在试验过程中若饮酒将自动终止试验。对照组：同期、同样方式招募健康志愿者；纳入标准：①不符合ICD-10 HUA诊断标准；②男性，18～65岁，右利手；③小学文化水平及以上，能完成量表评估、整夜睡眠监测及抽血检查；④对本研究知情同意，签署知情同意书。排除标准、终止标准同HUA组。

1.2 方法

1.2.1 研究流程 入组者入组后在监测第1晚由两名经统一培训并取得资质的医师对参与者的一般资料进行详细询问，采用自制的基本信息表，收集入组者的一般资料，主要包括姓名、性别、年龄、身高、体质量、体质量指数(BMI)、文化程度、职业、婚姻、饮酒史、吸烟史、安眠药使用史等；并进行睡眠质量评估；评估完成后进行多导睡眠监测(PSG)。第1晚为适应性监测，被试者按他们习惯的时间睡觉，在他们习惯的清醒时间醒来或记录8 h后叫醒;第2晚只进行正式睡眠监测，在他们习惯的清醒时间醒来或记录8 h后被叫醒，并进行血液标本采集。

1.2.2 主观睡眠状况评估 采用匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)，评估被试者最近1个月的整体睡眠质量；包括主观睡眠质量、入睡时间、睡眠时间、睡眠效率、睡眠障碍、催眠药物及日间功能等7个维度。每个维度用0～3分的4级评分法，总分21分，得分越高表示睡眠质量越差。

1.2.3 客观睡眠状况评估 采用Compumedics E-series多导睡眠记录系统对入组者进行两晚睡眠监测，第1晚为适应性监测，第2晚为正式监测；监测开始前24 h禁止饮酒；采集睡眠数据，包括总记录时间(TRT)、总睡眠时间(TST)、睡眠潜伏期(SL)、睡眠效率(SE，TST/TRT)、入睡后清醒时间(WASO)、非快速眼动1期睡眠(N1)、N1占比(N1/TST×100%)、非快速眼动2期睡眠(N2)、N2占比(N2/TST×100%)、非快速眼动3期睡眠(N3)、N3占比(N3/TST×100%)、快速眼动期睡眠(REM)、REM占比(REM/TST×100%)。将第2晚正式监测的数据根据美国睡眠医学会睡眠分期和相关事件判读规则2.5版进行人工分析数据。

1.2.4 昼夜节律相关基因mRNA表达测定 选取5种与昼夜节律相关的基因[钟基因(Clock)、周期基因1(Per1)、Per2、Per3、大脑和肌肉ARNT样蛋白-1基因(Bmal1)]进行mRNA表达测定。抽取入组者晨空腹外周血3 ml，并在2 h内分离出白细胞，加入Trizol试剂后，在-80 ℃条件下保存。使用Trizol法提取总RNA，测量RNA浓度后，将其逆转录为cDNA，并保存于-20 ℃。采用荧光定量聚合酶链反应法(PCR)测定昼夜节律基因的mRNA表达。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 HUA组22例、对照组21名符合入组条件并完成各项评估和检测。两组年龄、身高、婚姻、安眠药使用史、文化程度、职业的组间差异无统计学意义；HUA组体质量及BMI、吸烟年限明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2 两组昼夜节律相关基因mRNA表达比较 HUA组在Clock、Per3、Bmal1 mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 两组一般资料与昼夜节律相关基因表达水平比较例数)

2.3 两组睡眠状况评估比较 HUA组PSQI总分及睡眠效率维度评分明显高于对照组(P均<0.05)。HUA组TST、SE、N2期及REM期时间明显低于对照组(P均<0.05)，SL和WASO明显高于对照组(P均<0.05)。见表2。

表2 睡眠状况评估比较

2.4 影响昼夜节律相关基因mRNA表达的因素分析 对HUA组Clock1、Per1、Per2、Per3、Bmal1基因mRNA表达与饮酒年限、年龄、身高、体质量、BMI、PSQI评分、PSG观察指标的相关性分析显示，Clock基因mRNA表达与饮酒年限呈负相关(r=-0.434，P<0.05)。

3 讨论

本研究发现，与对照组相比，HUA组Clock、Per3、Bmal1的mRNA表达水平较明显下降， PSQI总分及睡眠效率维度评分明显增加，PSG观察指标TST及SE明显下降，SL和WASO明显增加。相关性分析发现，Clock基因mRNA表达与饮酒年限呈负相关。

昼夜节律基因的表达改变使体内的代谢活动也出现昼夜节律的紊乱[6]。多项研究发现，Clock和Bmal1基因表达的异常可以引起葡萄糖代谢改变，导致葡萄糖耐受性降低和胰岛素抵抗[7-8]。昼夜节律基因通过调节与细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡等相关基因的表达水平，在癌症的发生发展过程中发挥关键作用，如Clock基因与甲状腺乳头癌和结直肠癌有关，Bmal1基因与神经系统、消化系统及血液系统肿瘤有关，Per3基因与肝细胞癌和结直肠癌有关[9-12]。昼夜节律基因也参与了血压和心率、心肌细胞的代谢、血管内皮的功能以及血管的收缩和舒张等的调节，如Clock基因与动脉粥样硬化有关，Bmal1基因与高血压与动脉粥样硬化有关[13]。另外，昼夜节律基因在精神病理学行为改变中也有着重要的作用[14]。早期帕金森病患者的Bmal1基因表达改变，并且有睡眠行为的改变[15]。Clock、Bmal1、Per3的基因多态性被发现与季节性抑郁症有关，Clock基因的突变可导致小鼠抑郁样行为的增加[16-17]。Per3基因的突变将出现更高的特质焦虑分数，Clock基因也被发现与焦虑有关[16,18]。相关研究结论为HUA患者的躯体及精神损害的治疗提供更多可供研究的靶点。

本研究表明，HUA者的SL延长、WASO增加、TST和SE相对减少；表明这些患者的睡眠障碍在临床中主要体现在睡眠时间缩短、睡眠起始困难、睡眠连续性的破坏。这与大部分相关研究结果一致并互为补充：健康人大量饮酒时SL会减少，但HUA者SL增加[19]。较对照组而言，大量饮酒的人出现睡眠异常，表现为 WASO增加、睡眠效率下降[3]。另一项研究发现，HUA对睡眠时间及效率的影响集中在后半夜，表现为WASO及觉醒次数增加[20]。然而对饮酒的青少年研究结论略有不同：与对照组相比，TST和SL没有明显差异，只在下半夜出现WASO增加、SE和N3期睡眠减少[21]。考虑结论不一致的原因主要与酒精使用年限有关。此外，虽然本研究也发现HUA组的N2期和REM期时间明显减少，但N2期和REM期占比无明显减少，这与TST整体减少有关，表明酒精对睡眠各期结构的影响较为有限。

本研究发现饮酒年限与Clock基因表达有关。这一结论受到实验动物研究结果的支持：Clock基因突变小鼠显示出异常的酒精偏好，导致酒精摄入量显著增加[22]；HUA导致小鼠腹侧被盖区中 Clock基因表达的下降[23]。对酒精依赖患者的研究也与本文结论一致，且戒断1周后Clock基因恢复也非常有限[4]。但也有研究发现Clock基因与HUA并不直接相关，而是只有在共病抑郁症时才相关[24]。另一项研究发现Bmal1基因与HUA有关，但未发现Clock基因的相关性[25]。这两项研究是对大样本人群基因多态性进行的研究，因此与本研究在样本量和实验方法上存在不同，可能导致的结果不一致。

本研究的优势有以下几点：首先，相比于已经出现依赖综合征的情形，HUA在现实生活中更加常见，有利于结果的推广。其次，比起单纯主观感受，PSG结果更加精准地呈现出HUA对被试睡眠起始和连续性的损害，而对睡眠结构的破坏有限。最后，将昼夜节律基因纳入HUA和睡眠障碍之间进行分析，结果表明昼夜节律基因在其中可能起间接调节作用，这为以后的研究者提供另外的思考途径。本研究不足在于样本量较少、单一时间节点的基因表达水平不能反映昼夜节律基因24 h变化、外周血中的昼夜节律基因表达只能间接反映实际在中枢神经系统中参与昼夜节律调节的因子的水平。

综上所述，HUA者Clock、Per3、Bmal1基因表达下降，并且出现了睡眠时间、效率及睡眠连续性的下降和睡眠起始困难。这些行为改变的分子机制仍需进一步的探讨，以便能更好对HUA者出现的睡眠问题进行干预。