常振宇，李家奎，2，董海龙，张笑冰，吴庆侠*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.华中农业大学 动物医学学院，湖北 武汉 430070)

铜元素是动物生命活动中必不可少的金属元素之一，与机体的生长、繁殖、免疫、新陈代谢、造血、器官正常运行等生命活动有紧密的联系[1-3]。纳米技术是20世纪80年代末提出并快速发展起来的一种科学技术，纳米微粒是指粒径为1～100 nm的细小物质微粒[4]。纳米微量元素添加剂由于其比表面积大，所以其催化效率和表面反应活性较高，吸附能力更强，近年来受到了广泛的关注[5-6]。铜作为畜禽生长所必需的微量元素，是饲料添加剂中必不可少的原料，但高铜饲料的滥用，不仅对动物机体造成肝脏和肾脏等器官的直接损害，经家禽粪便排出的铜还对生态环境造成巨大污染。目前国内外关于纳米氧化铜(nano-CuO)对动物机制研究还不成熟，迄今为止，纳米饲料添加剂在藏鸡体内的吸收、代谢和生物学作用的研究报道较少。肝纤维化是由于多种致病因子所导致的肝内结缔组织异常增生，任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的产生，转化生长因子β1( transforming growth factor-β1，TGF-β1) 在肝纤维化的启动、进展中发挥着关键作用，与肝星形细胞向肌成纤维化细胞的转化有着密切联系[7-9]。有研究发现nano-CuO有利于促进动物生长[10]，但详细的添加剂量还有待探讨。本研究通过对比分析不同浓度梯度的nano-CuO对藏鸡肝脏TGF-β1 mRNA、蛋白表达水平的影响以及肝脏的病理学变化，探讨nano-CuO作为饲料添加剂在藏鸡饲养中的安全添加剂量，为藏鸡养殖中实际应用nano-CuO饲料添加剂提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组选取西藏农牧学院畜牧场的健康藏鸡120羽，随机分成4组，每组30羽，空白对照组藏鸡饲喂无任何铜添加剂饲料，低、中、高剂量nano-CuO组藏鸡分别饲喂5,50,100 mg/kg nano-CuO饲料，藏鸡自由采食，于14日龄开始，连续饲喂不同剂量的nano-CuO，试验期2周，于28日龄心脏采血 10 mL，1 000 r/min离心20 min，取上清液，-20℃保存，用于生化指标的检测。采用空气静脉注射法处死藏鸡，宰杀取肝脏组织，保存于液氮中。基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 藏鸡基础日粮组成及营养水平 %

1.2 主要仪器与试剂高速冷冻离心机(型号为3K15，Sigma)；莱卡组织切片机(型号为RM-2245)；光学显微镜(型号为CX41)；原子吸收分光光度计(型号为AA-6630C)；TGFβ抗体(武汉谷歌生物公司)；TBS浓缩缓冲液、中性树胶、水杨酸甲酯、二甲苯、福尔马林、PVDF 膜、显影定影试剂、转移缓冲液、电泳缓冲液等。

1.3 微量元素的测定称取一定量的藏鸡肾脏和肝脏样品，65℃烘干，粉碎再次称取1.0～2.0 g，烘干样品置于马弗炉中，250℃碳化至无烟后，650℃灼烧3 h，冷却后加10 mL盐酸和0.3 mL硝酸煮沸溶解，定容至50 mL容量瓶，用原子吸收分光光度计测定组织中铜、铁、锌的含量。

1.4 组织切片HE染色固定组织修整与水洗，分别将组织置于梯度酒精中进行脱水；将脱水后的组织浸在水杨酸甲酯中过夜处理；提前将蜡块反复冻融后放置在65℃温箱内依次浸蜡，组织包埋，RM-2245组织切片机切片；将毛笔上的组织片用镊子轻轻拉起，然后轻拖着铺于40%酒精上预展，组织片基本无皱褶后用1个玻璃片轻轻捞起放入温水中使其完全展开；用载玻片轻轻将组织片捞起，将载玻片45°倾斜放置，于烘片机上烘2 h；二甲苯、梯度酒精进行脱蜡，苏木素、伊红染液染色，脱水透明，中性树胶滴在脱水好的载玻片组织上封片。将封好的切片用 Olympus 光学显微镜进行观察并拍照，记录结果。

1.5 免疫组化检测TGF-β1藏鸡肺动脉平滑肌组织经包埋切片后，3% H2O2溶液避光室温条件下作用30 min；修复缓冲液进行抗原修复，3% TBST 封闭，分别滴加兔抗鼠TGF-β 抗体(1∶100)、山羊抗兔 HRP- IgG为二抗，孵育，按说明书进行二氨基联苯胺法显色操作；苏木素染液复染2 min，梯度酒精脱水、透明和封片(用 PBS缓冲液替代一抗作阴性对照)，应用Olympus光学显微镜进行观察并拍照。

1.6 实时荧光定量PCR检测TGF-β1 mRNA水平表达提取藏鸡肝组织 RNA，用核酸定量仪检测 RNA的浓度和纯度，所得 RNA 通过反转录合成 cDNA，-20℃保存。以 β-actin 为内参基因，引物见表2，检测 TGF-β1 mRNA 表达量。实时荧光定量 PCR 反应体系 25 μL:2×qPCR Mix 12.5 μL，2.5 μm 内标引物 2.0 μL，反转录产物 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件:95℃ 1 min;95℃ 5 s，72℃ 20 s，72℃ 5 min，40个循环。用 LightCycler 96 进行荧光检测，并用 2-ΔΔCt方法进行相对定量分析。

表2 引物信息

2 结果

2.1 不同剂量的nano-CuO对藏鸡金属沉积的影响由表3可知，在藏鸡肝组织中铜含量随着nano-CuO添加剂量的增加呈上升趋势，其中100 mg/kg nano-CuO组增加最多，并显著高于其他各组(P<0.01)，5,50 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异显著(P<0.05)；肝组织中铁含量随着铜添加剂量的增加呈减少趋势，且与对照组相比差异显著(P<0.05)；肝组织中锌含量受饲料中铜含量的影响较小，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。在肾脏组织中铜含量随着饲料中铜添加剂量的增加呈增加趋势，5 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异显著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO组与对照组之间差异极显著(P<0.01)；肾脏组织中铁含量随着铜添加剂量的增加呈减少趋势，除5 mg/kg nano-CuO组之外，其他两组与对照组之间差异极显著(P<0.01)；50 mg/kg nano-CuO组相对对照组降低较少(P<0.05)。肾脏组织中锌含量受饲料中铜含量影响不大，各组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。

表3 不同剂量的铜对藏鸡肝脏、肾脏中铜、铁、锌活性的影响 mg/kg

2.2 不同剂量的nano-CuO对藏鸡血清中铜、铁、锌含量的影响由表4可知，藏鸡血清中铜含量随着铜添加剂量的增加呈现增加的趋势，其中100 mg/kg nano-CuO组比对照组有显著的增加(P<0.01)，但是除100 mg/kg nano-CuO组外，其余各组与对照组没有显著性差异(P>0.05)；血清中铁含量随着铜添加剂量的增加也呈现增加的趋势，5 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异显著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异极显著(P<0.01)；血清中锌含量随着铜添加剂量的增加逐渐减少，5，50 mg/kg nano-CuO组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO组比对照组相比差异极显著(P<0.01)。

表4 不同形式和剂量的铜对藏鸡血清中铜、铁、锌含量的影响 mg/L

2.3 HE染色组织观察结果通过HE染色镜检发现，与正常对照组藏鸡肝脏(图1A)相比，5 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝脏肝小叶轮廓清晰，无病变出现(图1B)；50 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝细胞有轻微水泡变性和颗粒变性，并有血细胞渗出(图1C)；100 mg/kg nano-CuO组以颗粒变性为主，水泡变性较50 mg/kg nano-CuO组更严重，中央静脉扩张(图1D)。

A.对照组肝脏;B.5 mg/kg nano-CuO组肝小叶轮廓清晰;C.50 mg/kg nano-CuO组肝细胞轻微水泡变性;D.100 mg/kg nano-CuO组颗粒变性为主，水泡变性更加严重,中央静脉扩张。①轻微水泡变性;②中央静脉扩张;③颗粒变性;④水泡变性

2.4 TGF-β1免疫组化结果免疫组化结果表明，100 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝组织表现出明显的棕黄色、黄色，阳性表达强烈(图2A)，空白对照组和5,50 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝组织有弱阳性反应，颜色较浅(图2B～D)。阴性对照组(不加一抗)，则无阳性反应显色(图2E)。

A.100 mg/kg nano-CuO组；B.空白对照组；C.5 mg/kg nano-CuO组；D.50 mg/kg nano-CuO组；E.阴性对照组

2.5 RT-qPCR方法检测肝组织 TGF-β1 mRNA水平由图3可见，与对照组相比，5，50 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝脏 TGF-β1 mRNA 水平未发生明显变化(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝脏 TGF-β1 mRNA 水平显著升高(P<0.01)。

图3 藏鸡肝脏组织中TGF-β1 mRNA表达水平检测

3 讨论

本试验通过检测肝脏、肾脏及血清中铜、铁、锌含量发现，nano-CuO组随着铜添加剂量的增加，肝脏、肾脏和血清组织中铜的含量逐渐增加，结果与有关报道相一致[11-14]。何欣等[15]发现肝脏作为动物体内重要的储铜库，肝脏中铜含量的水平直接受到日粮铜水平的影响。同时张苏江等[16]发现肝脏中铜含量的变化与血清中铜浓度的变化呈正比。本试验发现，与对照组相比，5 mg/kg nano-CuO组中肾脏的铜含量变化不明显。另外，大多数组织中铜含量与铁、锌含量呈负相关，肝脏中表现最为明显。出现这种情况的原因是：动物体内铜、铁、锌的代谢具有密切的关系，吸收的铜主要以铜蓝蛋白的形式转运到各组织器官，试验中随日粮铜浓度增加，血中铁的浓度增加，由于铜蓝蛋白能提高铁的代谢和转运，血中铜蓝蛋白浓度的增加使血铁的含量也增加。同时，由于铜、铁、锌元素之间存在一定的拮抗作用，高铜饲粮对组织中铁、锌含量有一定的影响。铜阻碍了铁、锌在动物体内的吸收和存积，导致组织中铁含量的降低，其拮抗机制有研究表明[17-19]，铜只有与其转运的相关蛋白质相结合后才能被吸收，而铜离子有相同或相似的转运蛋白结合位点，由于竞争关系从而导致铜的吸收与铁、锌的吸收呈负相关。

组织切片观察发现，在饲料中添加50 mg/kg的nano-CuO时，肝组织出现有轻微的水泡变性和颗粒变性，但组织结构清晰。随着日粮中铜添加水平的增加，细胞出现严重的颗粒或水泡变性，当饲料中nano-CuO含量达到100 mg/kg时，可导致藏鸡肝组织发生明显的病理学变化，细胞结构开始消失，特别是在100 mg/kg nano-CuO组肝小叶的中央静脉已经发生了扩张。出现这种情况，说明nano-CuO更容易进入肝组织形成沉积，从而导致其组织结构发生变化。

研究表明，TGF-β1 属于TGF-β超家族，是目前公认的致纤维化的最强细胞因子，细胞的免疫功能、分化和生长都与之调节有关[20]。当肝脏受到损伤时，窦内皮细胞、肝枯否细胞以及坏死的肝细胞等通过旁分泌或自分泌方式生成TGF-β1。本试验发现，5,50 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝组织 TGF-β1含量无明显变化，100 mg/kg nano-CuO组藏鸡肝组织TGF-β1表达显著升高。由此说明，当饲料中nano-CuO剂量超过100 mg/kg时，会对藏鸡机体造成直接损害，饲料中nano-CuO添加剂质量浓度应控制在5～50 mg/kg。