杨雅雯，李 姿，张 竞，王改丽，兰云刚，李 芳，贺文琦，高 丰，宋德光*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062；3.青岛易邦生物工程有限公司 动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东 青岛 266144)

猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)引起的一种猪的传染病，根据临床症状可分为呕吐型、脊髓炎型和流感型。仔猪为PHEV易感群体，死亡率较高，该病在全世界多个国家均有发生和流行，给养猪业造成严重的经济损失，目前尚无特效的治疗药物和疫苗[1-2]。

天然免疫是机体抵抗病毒侵略的第一道防线，干扰素(IFN)是参与天然免疫应答的主要细胞因子，且β-干扰素(IFN-β)在抗病毒免疫中扮演着重要角色。病毒在感染复制过程中产生一种特殊的保守结构，称为病原相关分子模式(PAMPs)，其被模式识别受体(PRRs)识别，经过一系列级联信号分子的激活，最终诱导IFN-β的产生，并被IFN受体识别，发挥其抗病毒的免疫作用[3-5]。

已有研究表明，PHEV感染细胞早期能够抑制树突状细胞分泌IFN-β[6]，而病毒蛋白在此过程中的作用及机制尚不清楚。故本研究利用多个病毒蛋白重组载体进行筛选，证明PHEV核衣壳(N)蛋白能够抑制IFN-β表达，并且N蛋白对IFN-β的拮抗作用是通过与宿主细胞MAVS互作实现的。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株和质粒小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)、人肾上皮细胞(HEK-293T)、重组质粒(pcDNA3.1(-)-MAVS、eGFP-IRF3、myc-IRF3、IFN-β-luc、IRF3-luc、NF-κB-luc)以及PHEV-67N毒株(登录号：AY078417)，均由吉林大学分子病理解剖实验室保存。

1.2 主要试剂LipofectamineTM3000转染试剂购自Invitrogen公司；放线菌酮、多聚次黄嘌呤-胞嘧啶核苷酸(Poly(I∶C))购自InvivoGen公司；MDA5、MAVS、IRF3、e-GFP、myc、flag等单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；TRIzol reagent、SYBR Green Ⅰ购自Rocha公司；Mouse Interferon Beta ELISA Kit购自PBL公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

1.3 真核表达载体的构建参照GenBank中PHEV(登录号：AY078417)编码的M、N、E、nsp8、nsp9、nsp10、ns2、ns4.9以及ns12.7蛋白基因序列，利用Primer Premier 5.0进行特异性引物设计(表1)。PCR扩增上述基因，克隆至真核表达载体pEGFP-N1或pCMV-N-flag。

表1 PCR引物序列

1.4 细胞培养与转染将RAW264.7或HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞生长密度为60%时，根据LipofectamineTM3000说明书进行转染操作。其中，Poly(I∶C)转染剂量为4 μg/孔，各种质粒转染剂量为2～4 μg/孔。

1.5 荧光定量PCR检测PHEV及IFN-β mRNA表达将生长状态良好、生长密度为70%的RAW264.7细胞，接种PHEV(MOI=2或10)，16 h后，进行放线菌酮(100 mg/L)处理；药物作用8 h后，TRIzol法提取总RNA，反转录形成cDNA。利用特异性引物检测PHEV以及IFN-β mRNA表达水平。荧光定量PCR反应条件：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环；70℃ 10 min。以次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)为内参计算相对表达量，引物序列见表2。

表2 荧光定量PCR引物序列

1.6 Western blot检测收集预处理的RAW264.7或HEK-293T细胞，加入RAPI裂解液(含1% PMSF)于冰上裂解。加入SDS缓冲液进行SDS-PAGE电泳，并湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜；PBST洗涤3次，羊抗兔或羊抗鼠二抗于37℃孵育1 h，PBST洗涤后，进行显影。

1.7 双荧光素酶报告基因系统检测将HEK-293T细胞接种至12孔板，待细胞密度达到60%时，分别将PHEV主要病毒蛋白重组质粒(eGFP-N、flag-M、flag-nsp8、flag-nsp10、flag-ns4.9、flag-E、flag-nsp9、flag-ns2、flag-ns12.7)与萤火虫荧光素酶报告基因质粒(IFN-β-luc、IRF3-luc、NF-κB-luc)以及海肾荧光素酶报告基因质粒(pRL-TK)进行共转染，同时设置空载对照组。于转染后16 h，进行Poly(I∶C)刺激处理，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测目标基因的荧光信号强度。

1.8 免疫共沉淀试验将生长状态良好的HEK-293T细胞铺至6孔细胞培养板，待细胞密度为70%～80%时，进行转染试验。转染24 h后收集细胞并进行裂解，裂解产物分为两部分：一部分作为input对照；另一部分加入相应抗体，与蛋白A/G琼脂糖珠混合孵育(4℃过夜)，得到免疫共沉淀复合物，经裂解液洗涤后，进行Western blot检测。

1.9 酶联免疫吸附试验(ELISA)将PHEV N蛋白真核表达质粒(eGFP-N)转染至RAW264.7细胞，16 h后再次转染Poly(I∶C)，8 h后收集上清液，根据Mouse Interferon Beta ELISA kit说明书进行IFN-β表达量检测。

1.10 统计学分析所有数据利用IBM SPSS Statistics 19进行t检验统计分析。P<0.05具有统计学意义。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 结果

2.1 PHEV病毒蛋白合成能够抑制IFN-β表达RAW264.7细胞接种PHEV(MOI=2或10)后，进行放线菌酮处理以抑制病毒蛋白合成。荧光定量PCR及Western blot检测发现，随着病毒蛋白合成的减少(图1A、B)，IFN-β生成量增加(图1C)，表明PHEV编码的病毒蛋白能够拮抗IFN-β分泌。

A.放线菌酮处理感染病毒的细胞后PHEV mRNA检测；B.放线菌酮处理感染病毒的细胞后PHEV N蛋白水平检测；C.放线菌酮处理感染病毒的细胞后IFN-β mRNA检测

2.2 PHEV N蛋白抑制Poly(I∶C)诱导的IFN-β表达为筛选能够抑制IFN-β表达的病毒蛋白，本研究分别将PHEV主要病毒蛋白重组质粒与IFN-β-luc、pRL-TK共转染至HEK-293T细胞。双荧光素酶报告基因系统检测表明，PHEV N蛋白能够显著抑制IFN-β表达，病毒其他结构蛋白(M和E)和非结构蛋白(ns2、ns4.9、ns12.7、nsp8、nsp9和nsp10)对IFN-β启动子活性无显著性影响(图2A)。将PHEV N蛋白重组质粒(eGFP-N)转染至RAW264.7细胞，ELISA检测进一步证明，PHEV N蛋白高表达显著抑制IFN-β分泌(图2B)。

2.3 PHEV N蛋白抑制IRF3活性IFN-β的产生需要IRF3和转录因子κB(NF-κB)二者协同刺激作用[7]，为探究PHEV N蛋白对IRF3和NF-κB活性的影响，本研究将eGFP-N与萤火虫荧光素酶报告基因质粒(IRF3-luc、NF-κB-luc)以及内参质粒pRL-TK共转染至HEK-293T细胞。双荧光素酶报告基因系统检测发现，PHEV N蛋白可以抑制IRF3启动子活性(图3A)，但对NF-κB启动子活性无显著性影响(图3B)，表明IRF3或IRF3上游信号分子为N蛋白调控IFN通路的作用靶标。

A.双荧光素酶系统筛选抑制IFN-β表达的病毒蛋白；B.ELISA方法验证N蛋白抑制IFN-β表达的作用

A.双荧光素酶报告系统检测N蛋白对IRF3启动子活性的影响；B.双荧光素酶报告系统检测N蛋白对NF-κB启动子活性的影响

2.4 PHEV N蛋白通过与MAVS信号分子互作抑制IFN-β产生为进一步确定PHEV N蛋白调控的IRF3上游信号分子靶标，本研究将RIG-I样受体信号通路中IRF3的重要上游调控分子——线粒体抗病毒信号蛋白(pcDNA3.1(-)-MAVS)与eGFP-N、IFN-β-luc以及内参质粒pRL-TK共转染至HEK-293T细胞。双荧光素酶报告基因系统检测表明，PHEV N蛋白能够显著降低MAVS诱导的IFN-β启动子活性(图4A)，提示MAVS是PHEV N蛋白拮抗IFN-β产生的潜在靶标。将eGFP-N和pcDNA3.1(-)-MAVS共转染至HEK-293T细胞，免疫共沉淀试验分析表明，PHEV N蛋白与MAVS信号分子存在相互作用(图4B)，证明PHEV N蛋白通过MAVS信号分子抑制IFN-β产生。

A.双荧光素酶系统筛选PHEV N蛋白的潜在作用靶点；B.免疫共沉淀验证PHEV N蛋白与MAVS互作

3 讨论

机体先天性免疫应答时产生的干扰素作为抵抗病毒作用的天然屏障具有重要意义，尤其在缺乏疫苗免疫的情况下至关重要。宿主细胞通过识别病原相关分子模式，进一步激活多级信号分子，最终诱导干扰素表达，从而发挥抗病毒作用。猪血凝性脑脊髓炎作为一种高度接触性传染病，具有较高的致死率，在世界范围内广泛传播和流行，对养猪业构成严重威胁[8]。由于目前尚无有效的疫苗和药物，早期的发现和防控成为预防该病的重点；因此，深入研究PHEV感染与宿主免疫应答的调控机制具有重要的科学意义。

在系统长期进化过程中，许多冠状病毒(包括α、β、γ、δ属)演化出拮抗宿主免疫系统的机制，且病毒蛋白是揭开病毒免疫逃避作用的重要突破口。PHEV与急性重症呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、鼠肝炎病毒(MHV)等同属于β冠状病毒属成员，且已被证明能够抑制树突状细胞中IFN-β表达[6]，这一结果初步解释了PHEV强致病性和高死亡率存在的可能原因——IFN-β不能在感染初期消灭病毒，病毒有足够的时间复制增殖，从而发挥致病作用。

放线菌酮又名环乙酰亚胺，是由链霉菌产生的戊二酰亚胺类抗生素，具有广谱、强抗病毒活性的特点，在体外抑制大多数真核生物蛋白的合成，被广泛应用于体外真核细胞过程研究[9]。本试验通过放线菌酮药物处理感染病毒的细胞，明确PHEV病毒蛋白合成对IFN有拮抗作用，并以此为突破口展开研究。已有研究证明，牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)至少可编码3个特定蛋白用于拮抗免疫应答反应[10]。丙型肝炎病毒(HCV)的ns2蛋白通过抑制TANK结合激酶1(TBK1)和IκBε激酶(IKKε)复合物拮抗宿主细胞的抗病毒应答[11]。中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)M蛋白通过抑制IRF3磷酸化拮抗Ⅰ型IFN表达[12]。SARS-CoV中有11种病毒蛋白具有IFN拮抗作用，其中nsp1蛋白通过影响IRF3二聚化而抑制IFN-β表达，PLP蛋白通过阻断STING-TRAF3-TBK1复合物形成实现免疫逃避[13-14]。本研究构建PHEV多种结构蛋白以及非结构蛋白真核表达质粒，通过筛选发现，N蛋白拮抗功能最为明显。N蛋白是一类表达早、丰度高、功能保守且多样的核衣壳蛋白。据报道，MHV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)等冠状病毒的N蛋白均能通过不同的分子机制拮抗IFN-β产生[15-18]，可见冠状病毒调控抗病毒天然免疫的机制非常复杂。

为了进一步解析PHEV N蛋白拮抗IFN-β产生的机制，本研究通过将PHEV-N与IFN信号通路的信号分子互作，初步筛选出MAVS为潜在的互作靶标。据报道，PRRs识别PAMP后将信号通过MAVS传递给下游的TBK1-IKK-TRAF3复合体，从而激活IRF3和NF-κB等信号通路，以诱导Ⅰ型IFN表达，故MAVS是IFN信号通路的枢纽，具有衔接作用[3]。MAVS既可定位线粒体，也可定位于过氧化物酶体；因定位不同，发挥的抗病毒免疫机制不同，迄今已发现30多种分子可与MAVS相互作用[19]。多种病毒可编码MAVS负调控分子，如HCV编码的NS3/4A通过裂解MAVS，使其不再定位于线粒体而丧失激活下游信号分子的功能[20]；人类冠状病毒NL6 PLP蛋白酶破坏MAVS-STING-TBK1/IKK复合体，阻断MAVS功能的正常发挥，从而实现免疫负调控过程[21]。但PHEV感染过程中，MAVS定位的变化情况以及是否有其他信号分子参与N蛋白与MAVS的互作过程，仍需进一步深入研究。

本研究从病毒蛋白角度，证实PHEV可通过其自身合成的N蛋白与宿主细胞MAVS相互作用，从而抑制IFN-β产生。该结果有利于对PHEV致病性及逃避宿主免疫应答的理解，同时也可为疫苗设计及药物靶标筛选提供新的思路。