张 弓黄剑林

（延安大学附属医院临床药学科，陕西 延安716000）

转移生长因子⁃β（TGF⁃β）是一种具有多种生物学功能的细胞因子，可调控多种细胞（如巨噬细胞、T 细胞和B 细胞、造血细胞、中性粒细胞和树突细胞等）的增殖、分化、凋亡、粘附和迁移。TGF⁃β 包括3 个异构体，分别为TGF⁃β1、TGF⁃β2、TGF⁃β3。其中TGF⁃β1 在组织纤维化和组织修复过程发挥重要作用，TGF⁃β1 可通过激活TGF⁃β／Smad 信号通路而引发组织器官产生纤维化。而且，大量研究表明多种癌症（如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌等）的发生与TGF⁃β1 的高表达具有密切联系。因此，TGF⁃β1 抑制剂的开发在器官纤维化以及多种癌症的治疗中具有广阔的应用前景［1］。

藏药典籍《晶珠本草》 中记载阿仲具有“清肺中之热，止咳，治肺炎”等功效。阿仲的基源药材有多种，团状雪灵芝Arenaria polytrichoides是其中一种，隶属于石竹科蚤缀属，为多年生垫状草本植物，主要分布于西藏、四川西部和青海东南部海拔3 500～5 300 m 的高山草甸、倒石堆和碎石带地段［2⁃3］，截止到目前，关于团状雪灵芝化学成分的报道甚少，伍贤学等［4⁃5］首次报道了该植物中的10 个化合物；王国军等［6］从该植物中分离得到10个化合物，其中8 个为首次获得，并对其抗炎活性进行了评价。

本课题组一直致力于从传统藏药中筛选TGF⁃β1 抑制剂的研究，并将所筛选的活性化合物用于肺纤维化和肺癌的治疗。团状雪灵芝在藏族同胞生活区域被广泛用于肺间质性疾病的治疗，中医将肺纤维化归为肺间质病，所以，本实验拟对团状雪灵芝的化学成分和抑制TGF⁃β1 活性进行研究，通过多种色谱分析分离技术和波谱解析方法结合体外细胞筛选模型，对团状雪灵芝抑制TGF⁃β1 的化学成分进行探究，以期为其临床治疗肺间质病提供理论依据，为其进一步开发应用提供参考。

1 材料

AM⁃600核磁共振仪（TMS为内标，德国Bruker 公司）；Saturn 2200 型高分辨质谱仪（美国Varian 公司）；硅胶GF254（青岛硕远硅胶科技有限公司）；D101 大孔吸附树脂、柱色谱硅胶（100～200 目）、微孔树脂CHP20P（日本三菱化学公司）；安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；LC⁃600P 制备液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；反相TSKgel ODS⁃100V C18色谱柱［250 mm×20 mm、250 mm×4.6 mm，东曹（上海）生物科技有限公司］；BSC⁃1600IB2 型生物安全柜 ［苏洁医疗器械（苏州）有限公司］；HF160WCO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；CKX41SF 倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。96 孔板、细胞培养皿（上海晶安生物科技有限公司）；Gibco 胎牛血清［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；比菲尼酮［美国西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；ELISA（TGF⁃β1）检测试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）；RAW264.7 细胞株（中国南京科佰生物科技有限公司）。团状雪灵芝全草购于青海省西宁市康乐药材市场，经中国科学院三江源国家公园研究院卢学锋研究员鉴定为石竹科蚤缀属的团状雪灵芝Arenaria polytrichoides。

2 提取与分离

取阴干后团状雪灵芝全草，粉碎后称取9 kg，室温下用90%乙醇进行浸取，每次8 h，共3 次，料液比为1 ∶8，所得浸取液收集后减压真空浓缩，浓缩至一定体积，于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得粉末状提取物527 g，称取300 g，加适量水混悬分散，上样于大孔吸附树脂，分别以水、20%乙醇⁃水、40%乙醇⁃水、60%乙醇⁃水、80%乙醇⁃水、100% 乙醇⁃水进行梯度洗脱，减压回收洗脱剂，TLC 薄层点板合并得到F1（39 g）、F2（85 g）、F3（42 g）、F4（20 g）4 个组分。称取80 g F2 组分，加硅胶适量进行拌样，过硅胶柱色谱，三氯甲烷⁃甲醇（30 ∶1、25 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1）进行梯度洗脱，得到5 个组分F2⁃1～F2⁃5，F2⁃3 经MCI 微孔树脂柱色谱，分别以20% 甲醇⁃水、40%甲醇⁃水、60% 甲醇⁃水、80% 甲醇⁃水、100% 甲醇进行梯度洗脱，得到化合物1（6.4 mg）、6（5.2 mg）、9（7.3 mg）和5 个组分F2⁃3⁃1～F2⁃3⁃5，F2⁃3⁃1 经过硅胶柱色谱，三氯甲烷⁃丙酮（25 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）进行梯度洗脱，得到5 个组分，半制备液相反复纯化，得化合物2（2.3 mg）、3（3.3 mg）、10（2.8 mg）、12（3.3 mg）、16（4.1 mg）；F2⁃3⁃2 经硅胶柱色谱，石油醚⁃乙酸乙酯（20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）梯度洗脱，得到4 个精细组分，经高效半制备液相色谱反复纯化，得化合物7（2.4 mg）、8（2.6 mg）、11（4.1 mg）、13（2.1 mg）；F2⁃3⁃3 经高效半制备液相色谱反复纯化，得化合物4（3.6 mg）、5（2.9 mg）、14（3.7 mg）、15（4.4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：215.3［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：7.24（1H，ddd，J＝7.6，1.2，0.8 Hz，H⁃6），7.32（1H，ddd，J＝8.2，7.1，1.2 Hz，H⁃7），7.51（1H，ddd，J＝8.2，1.1，0.8 Hz，H⁃8），8.24（1H，ddd，J＝7.6，1.2，0.8，H⁃5），11.74（1H，brs，H⁃9），13.22（IH，brs，H⁃2）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：158.1（C⁃l），156.8（C⁃3），169.1（C⁃4），120.4（C⁃5），122.8（C⁃6），125.3（C⁃7），112.7（C⁃8），114.6（C⁃11），122.0（C⁃12），136.7（C⁃13），134.2（C⁃20）。以上数据与文献［7］ 报道基本一致，故鉴定为1，2，3，4⁃四氢⁃1，3，4⁃三羰基⁃β⁃咔啉。

化合物2：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：431.1［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：5.21（1H，d，J＝7.5 Hz，H⁃1″），6.51（1H，d，J＝2.0 Hz，H⁃6），6.79（1H，d，J＝2.0 Hz，H⁃8），6.91（1H，s，H⁃3），7.03（2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃3′，5′），7.88（2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃2′，6′），12.87（1H，s，5⁃OH）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：162.4（C⁃2），101.1（C⁃3），181.0（C⁃4），160.2（C⁃5），98.9（C⁃6），162.0（C⁃7），93.8（C⁃8），156.0（C⁃9），104.2（C⁃10），121.8（C⁃1′），127.6（C⁃2′，6′），115.0（C⁃3′，5′），160.8（C⁃4′），99.6（C⁃1″），72.1（C⁃2″），75.5（C⁃3″），68.6（C⁃4″），76.3（C⁃5″），60.7（C⁃6″）。以上数据与文献［8］ 报道基本一致，故鉴定为芹菜素⁃7⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷。

化合物3：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：213.3［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：11.33（1H，s，H⁃9），8.39（1H，d，J＝5.5 Hz，H⁃3），8.37（1H，d，J＝5.5 Hz，H⁃4），8.21（1H，d，J＝8.0 Hz，H⁃5），7.67（1H，d，J＝8.0 Hz，H⁃8），7.59（1H，d，J＝8.0 Hz，H⁃7），7.28（1H，d，J＝8.0 Hz，H⁃6）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：140.8（C⁃1），134.3（C⁃3），117.3（C⁃4），121.2（C⁃5），128.6（C⁃6），119.8（C⁃7），112.7（C⁃8），130.8（C⁃10），118.8（C⁃11），130.9（C⁃12），134.8（C⁃13），164.7（1⁃COOH）。以上数据与文献［9］ 报道基本一致，故鉴定为β⁃咔啉⁃1⁃羧酸。

化合物4：淡黄色固体。ESI⁃MSm／z：241.6［M ＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.53（1H，d，J＝4.8 Hz，3⁃H），8.23（1H，d，J＝4.8 Hz，4⁃H），8.18（1H，dd，J＝7.6，0.7 Hz，5⁃H），7.57（2H，m，7⁃H，8⁃H），7.42（1H，ddd，J＝7.6，5.2，2.5 Hz，6⁃H），5.22（2H，s，2′⁃H），3.60（3H，s，⁃OCH3）；13C⁃NMR（150 MHz，CD3OD）δ：133.2（C⁃1），137.1（C⁃3），118.4（C⁃4），130.7（C⁃4a），120.5（C⁃4b），121.8（C⁃5），120.9（C⁃6），128.5（C⁃7），111.1（C⁃8），140.2（C⁃8a），134.2（C⁃9a），73.9（C⁃2′），198.6（⁃C ＝O），58.9（⁃OCH3）。以上数据与文献［10］ 报道基本一致，故鉴定为蚤缀碱A。

化合物5：淡黄色粉末。ESI⁃MSm／z：345.2［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：7.60（1H，s，H⁃5），7.69（1H，s，H⁃5′），3.96（3H，s，H⁃4′），3.98（3H，s，H⁃3′），3.99（3H，s，H⁃3）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：111.9（C⁃1），142.0（C⁃2），140.9（C⁃3），154.0（C⁃4），113.0（C⁃5），114.1（C⁃6），160.1（C⁃7），113.2（C⁃1′），141.9（C⁃2′），142.1（C⁃3′），155.3（C⁃4′），107.9（C⁃5′），113.9（C⁃6′），160.1（C⁃7′），58.0（4′⁃OCH3），61.9（3′⁃OCH3），63.8（3⁃OCH3）。以上数据与文献［11］ 报道基本一致，故鉴定为3，3′，4′⁃三⁃O⁃甲基鞣花酸。

化合物6：淡黄色粉末。ESI⁃MSm／z：285.1［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，CD3OD）δ：13.05（1H，s，5⁃OH），7.38（1H，dd，J＝2.5，7.5 Hz，H⁃6′），7.35（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃2′），6.87（1H，d，J＝7.5 Hz，H⁃5′），6.70（1H，s，H⁃3），6.50（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃8），6.16（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃6）；13C⁃NMR（150 MHz，CD3OD）δ：115.5（C⁃2），102.6（C⁃3），181.6（C⁃4），163.6（C⁃5），98.5（C⁃6），163.8（C⁃7），93.8（C⁃8），162.1（C⁃9），103.7（C⁃10），121.7（C⁃1′），149.7（C⁃2′），156.9（C⁃3′），145.6（C⁃4′），112.9（C⁃5′），118.9（C⁃6′）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为木犀草素。

化合物7：浅黄色粉末。ESI⁃MSm／z：179.3［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：6.20（1H，d，J＝14.5 Hz，H⁃8），6.81（1H，d，J＝8.5 Hz，H⁃5），6.89（1H，dd，J＝2.5，8.5 Hz，H⁃6），6.98（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃2），7.47（1H，d，J＝14.5 Hz，H⁃7）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：126.8（C⁃1），114.8（C⁃2），145.9（C⁃3），148.7（C⁃4），115.8（C⁃5），121.9（C⁃6），146.5（C⁃7），114.6（C⁃8），170.7（C⁃9）。以上数据与文献［13］ 报道基本一致，故鉴定为咖啡酸。

化合物8：棕黄色结晶（甲醇）。ESI⁃MSm／z：447.4 ［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：7.42（1H，dd，J＝8.7，2.0 Hz，H⁃6′），7.39（1H，d，J＝2.0 Hz，H⁃2′），6.91（1H，d，J＝8.7 Hz，H⁃5′），6.75（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃8），6.41（1H，d，J＝1.8 Hz，H⁃6），6.72（1H，s，H⁃3），5.12（1H，d，J＝6.9 Hz，Glu1″⁃H）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：163.5（C⁃2），102.2（C⁃3），180.9（C⁃4），160.2（C⁃5），98.6（C⁃6），163.0（C⁃7），93.8（C⁃8），156.0（C⁃9），105.3（C⁃10），121.4（C⁃1′），112.6（C⁃2′），144.6（C⁃3′），148.9（C⁃4′），116.0（C⁃5′），118.1（C⁃6′），98.9（C⁃1″），72.01（C⁃2″），75.4（C⁃3″），68.6（C⁃4″），76.7（C⁃5″），60.6（C⁃6″）。以上数据与文献［14］ 报道基本一致，故鉴定为木犀草素⁃7⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷。

化合物9：黄色结晶（甲醇）。ESI⁃MSm／z：431.2 ［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：12.96（1H，s，OH⁃5），10.81（1H，brs，OH⁃7），10.33（1H，brs，OH⁃4′），7.92（2H，d，J＝8.8 Hz，H⁃2′，6′），6.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H⁃3′，5′），6.82（1H，s，H⁃3），6.23（1H，d，J＝2.1 Hz，H⁃6），6.52（1H，d，J＝2.1 Hz，H⁃8）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：162.7（C⁃2），102.7（C⁃3），180.7（C⁃4），160.1（C⁃5），97.9（C⁃6），163.1（C⁃7），92.9（C⁃8），157.3（C⁃9）.102.8（C⁃10），121.2（C⁃1′），127.4（C⁃2′，6′），114.9（C⁃3′，5′），160.4（C⁃4′）。以上数据与文献［15］报道基本一致，故鉴定为芹菜素。

化合物10：黄色结晶（甲醇）。ESI⁃MSm／z：273.6 ［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：12.18（1H，s，5⁃OH），10.83（1H，s，7⁃OH），9.64（1H，s，4′⁃OH），7.38（2H，d，J＝8.4 Hz，H⁃2′，6′），6.85（2H，d，J＝8.8 Hz，H⁃3′，5′），5.90（2H，s，H⁃6，8），5.46（1H，dd，J＝13.2，3.0 Hz，H⁃ 2），3.29（1H，dd，J＝17.0，13.0 Hz，H⁃3α），2.69（1H，dd，J＝16.8，2.8 Hz，H⁃3β）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：77.5（C⁃2），41.0（C⁃3），195.5（C⁃4），162.5（C⁃5），94.8（C⁃6），165.7（C⁃7），94.0（C⁃8），162.0（C⁃9），102.8（C⁃10），127.9（C⁃1′），127.4（C⁃2′），114.2（C⁃3′），156.7（C⁃4′），114.2（C⁃5′），127.4（C⁃6′）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为柚皮素。

化合物11：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：463.1［M⁃H ］－。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：12.68（1H，s，5⁃OH），10.79（1H，s，7⁃OH），9.66（1H，s，4⁃OH），9.22（1H，s，3⁃OH），6.13（1H，d，J＝2.4 Hz，H⁃6），6.37（1H，d，J＝2.4 Hz，H⁃8），7.58（1H，d，J＝2.4 Hz，H⁃2′），6.91（1H，d，J＝8.4 Hz，H⁃5′），7.62（1H，dd，J＝8.4，2.4 Hz，H⁃6′），5.51（1H，d，J＝7.2 Hz，glc H⁃1），3.11～3.59（6H，m，glc H⁃2，3，4，5，6a，6b）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：155.8（C⁃2），132.9（C⁃3），176.7（C⁃4），160.6（C⁃5），97.8（C⁃6），163.8（C⁃7），92.9（C⁃8），155.7（C⁃9），102.7（C⁃10），120.7（C⁃1′），114.8（C⁃2′），143.9（C⁃3′），147.9（C⁃4′），115.7（C⁃5′），120.9（C⁃6′），101.1（C⁃1″），73.9（C⁃2″），75.8（C⁃3″），69.7（C⁃4″），76.9（C⁃5″），61.2（C⁃6″）。以上数据与文献［17］ 报道基本一致，故鉴定为槲皮素⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖。

化合物12：黄色针晶。ESI⁃MSm／z：331.0［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：12.32（1H，s，5⁃OH），7.69（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃2′），7.88（1H，dd，J＝2.5，8.0 Hz，H⁃6′），6.89（1H，d，J＝8.0 Hz，H⁃5′），6.69（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃8），6.29（1H，d，J＝2.5 Hz，H⁃6），3.79（3H，s，3′⁃OCH3），3.91（3H，s，7⁃OCH3）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：148.9（C⁃2），135.8（C⁃3），177.6（C⁃4），161.9（C⁃5），96.9（C⁃6），166.1（C⁃7），93.1（C⁃8），157.1（C⁃9），104.8（C⁃10），122.7（C⁃1′），114.1（C⁃2′），146.9（C⁃3′），148.8（C⁃4′），116.0（C⁃5′），123.6（C⁃6′），55.7（⁃OCH3），56.2（⁃OCH3）。以上数据与文献［18］报道基本一致，故鉴定为鼠李秦素。

化合物13：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：549.2［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：12.83（1H，s，5⁃OH），10.85（1H，s，7⁃OH），8.76（1H，s，4″⁃OH），7.28（2H，s，H⁃2′，6′），6.98（1H，d，J＝1.6 Hz，H⁃2″），6.95（1H，s，H⁃3），6.81（1H，dd，J＝8.2，1.6 Hz，H⁃6″），6.69（1H，d，J＝8.2 Hz，H⁃5″），6.48（1H，brs，H⁃8），6.16（1H，brs，H⁃6），4.85（1H，d，J＝5.0 Hz，H⁃7″），4.26（1H，m，H⁃8″），3.86（6H，s，3′，5′⁃OCH3），3.74（3H，s，3″⁃OCH3），3.64（1H，dd，J＝11.5，4.7 Hz，9″⁃CH2），3.27（1H，dd，J＝11.5，4.8 Hz，9″⁃CH2）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：181.6（C⁃4），166.0（C⁃7），162.8（C⁃2），161.4（C⁃5），157.5（C⁃9），153.0（C⁃3′，5′），147.0（C⁃3″），145.4（C⁃4″），139.8（C⁃4′），133.0（C⁃1″），125.5（C⁃1′），119.2（C⁃6″），114.7（C⁃5″），111.1（C⁃2″），104.7（C⁃3），104.3（C⁃2′，6′），103.3（C⁃10），99.4（C⁃6），94.5（C⁃8），86.9（C⁃8″），71.6（C⁃7″），60.4（C⁃9″），56.4（3′，5′⁃OCH3），55.6（3″⁃OCH3）。以上数据与文献［19］ 报道基本一致，故鉴定为salcolin A。

化合物14：黄色粉末。ESI⁃MSm／z：269.2［M＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：7.56（1H，d，J＝15.6 Hz，H⁃β），6.46（1H，d，J＝15.6 Hz，H⁃α），6.79（1H，d，J＝8.2 Hz，H⁃5），7.09（1H，d，J＝1.9 Hz，H⁃2），7.11（1H，dd，J＝1.9，8.2 Hz，H⁃6），3.60（2H，d，J＝6.2 Hz，H⁃1′），4.17（2H，d，J＝4.7 Hz，H⁃3′），3.88（1H，t，J＝4.7，6.2 Hz，H⁃2′）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：125.5（C⁃1），111.1（C⁃2），149.4（C⁃3），147.9（C⁃4），115.4（C⁃5），123.0（C⁃6），144.9（C⁃β），114.4（C⁃α），166.6（C ＝O），62.7（C⁃1′），65.5（C⁃2′），69.3（C⁃3′）。以上数据与文献［20］ 报道基本一致，故鉴定为1⁃O⁃feruloylg⁃lycerol。

化合物15：白色粉末。ESI⁃MSm／z：123.2［M ＋H］＋。1H⁃NMR（600 MHz，DMSO⁃d6）δ：9.82（1H，s，H⁃1），7.79（2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃3，3′），6.97（2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃5，5′）；13C⁃NMR（150 MHz，DMSO⁃d6）δ：190.5（C⁃1），163.1（C⁃2），132.1（C⁃3，3′），128.5（C⁃4），115.8（C⁃5，5′）。以上数据与文献［21］ 报道基本一致，故鉴定为4⁃羟基苯甲醛。

化合物16：无色油状液体。ESI⁃MSm／z：287.1 ［M⁃H］－。1H⁃NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.70（1H，dd，J＝5.5，3.0 Hz），7.59（1H，dd，J＝5.5，3.0 Hz），4.30（4H，m），1.51（4H，m），1.80（4H，m），0.93（3H，m），0.93（3H，m）；13C⁃NMR（150 MHz，CDCl3）δ：168.8（C⁃7），134.0（C⁃1，6），130.1（C⁃2，5），131.9（C⁃3，4），67.1（C⁃1′，1″），32.2（C⁃2′，2″），18.9（C⁃3′，3″），14.0（C⁃4′，4″）。以上数据与文献［22］ 报道基本一致，故鉴定为dibutyl⁃phthalate。

4 TGF⁃β1 抑制活性研究

4.1 药品制备 准确称量所得化合物和阳性对照药物比菲尼酮各4.0 mg，用DMSO 溶解制备成质量浓度为40 mg／mL 的母液备用，用不含有血清的培养基制成系列质量浓度的药液，用于TGF⁃β1 抑制活性筛选实验。

4.2 细胞培养 RAW264.7 细胞在含有10%血清的培养基及5% CO2、37 ℃、饱和湿度的标准条件下进行培养，待细胞贴壁生长达到培养瓶底约80%时进行传代，3 代后的RAW264.7 细胞用于TGF⁃β1 抑制活性检测。

4.3 活性检测 将处于对数生长期的贴壁细胞进行胰酶消化、重悬和计数，调整细胞浓度至1×105／mL，分别加至96 孔板的孔内，每孔0.1 mL，在标准条件下培养一定时间至细胞完全贴壁后进行饥饿处理，12 h 后弃去每个孔内的上清液，按照不同的分组情况（空白对照组、模型组、阳性药组和不同浓度给药组）分别加入总体积为0.1 mL相应的药液，各组给药浓度设置为空白对照组只加等体积的无血清培养基，模型组无血清培养基配制的1 μg／mL LPS，阳性药组1 μg／mL LPS＋质量浓度分别为0.5、1、3、5、7、9、11 μg／mL 的比菲尼酮，不同浓度给药组1 μg／mL LPS＋质量浓度分别为1、5、10、15、25、40、55 μg／mL 的化合物1～16，每组重复3 次，置于标准条件下培养12 h，吸取培养上清液用ELISA 方法检测化合物对TGF⁃β1 的抑制作用，并计算出各化合物的半数抑制浓度（IC50）值。

4.4 检测结果 图1 显示，化合物1～16 均对TGF⁃β1 呈现一定的抑制作用，阳性药比菲尼酮对TGF⁃β1 的IC50为3.68 μg／mL；1、3～4、6、11、13 对TGF⁃β1 呈现较强的抑制作用效果，IC50值分别 为 4.95、5.79、7.76、11.55、18.89、15.65 μg／mL，但均弱于阳性药；8～10、12、14 对TGF⁃β1 的IC50值分别为30、20.32、25.55、33.21、42.22 μg／mL，不及1、3～4、6、11、13，但明显强于2、5、7、15～16（IC50值分别为40、50、50、89.88、97.77 μg／mL）；15～16 对TGF⁃β1 几乎无抑制作用。

图1 各化合物对TGF⁃β1 抑制作用的IC50值（，n＝3）Fig.1 IC50 values of various compounds on TGF⁃β1（，n＝3）

5 讨论

特发性肺纤维化是一种严重危害人类生命的间质性肺病，特发性肺纤维化患者体内TGF⁃β1 表达量明显升高，有研究表明抑制TGF⁃β1 可有效缓解肺纤维化病人的纤维化进程［1］。藏药是我国传统中医药的重要组成部分，植物来源的藏药因其独特的生长环境（高海拔、强辐射、昼夜温差大等）使其次级代谢产物具有独特的治疗效果。本研究结果表明，团状雪灵芝中具有抑制TGF⁃β1 的强活性成分，主要以咔啉生物碱和黄酮类为主（化合物1、3～4、6、11、13），研究表明黄酮类化合物及咔啉生物碱具有明显抑制肺纤维化的药理活性［23⁃24］。本研究结果表明咔啉生物碱和黄酮类可能是团状雪灵芝临床治疗间质性肺病的主要药效成分，以期为其进一步深入研究提供实验依据，为筛选TGF⁃β1 抑制剂提供实验数据。