徐冬川，何蝉伊，林 琦，丁毅鹏

（海南省人民医院、海南医学院附属海南医院1.急诊科，2.全科医学科，海南 海口570311）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD）是一种慢性呼吸系统疾病，其主要特征是持续呼吸流量有限，肺功能不可逆［1］。有数据显示，2020年慢性阻塞性肺疾病已成为全球第四大死亡原因［2］。研究表明，有20%的吸烟者会发展成COPD患者，而终身吸烟者50%是COPD患者［3］。外 泌体（exosomes）是指囊泡结构中，含有RNA或者蛋白的具膜小泡，直径一般在40～100 nm［4］。外泌体通过其携带的信使RNA（mRNA），miRNA和蛋白质等作用于受体细胞，从而影响受体细胞的增殖与迁移［5，6］。大量研究证实，目前已发现多种外泌体的miRNA参与COPD的发生与发展［7，8］。本研究探讨香烟提取物（cigarette smoke ex⁃tract，CSE）对支气管上皮细胞16HBE外泌体miR⁃186表达量的影响，以及16HBE来源的外泌体miR⁃186对肺成纤维细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人支气管样上皮细胞16HBE和人胚成纤维细胞MRC⁃5购于中国科学院上海细胞库。胎牛血清（FBS），MEM和DMEM培养液购于美国Gibco公司。miR⁃186引 物、miR⁃186 mimic和 阴 性 载 体（NC）由上海吉玛制药技术有限公司合成。CCK⁃8试剂盒购于武汉华美公司。Bcl2L 11、GAPDH一抗和二抗购于Thermo公司。使用美国FEI透射电子显微镜进行外泌体拍照。双荧光素酶试剂盒购自Promega公司。

1.2 CSE的制备

20支市售黄金叶牌香烟完全燃烧产生的烟雾，充分混合溶于20 mL无血清DMEM培养基中，之后使用0.22μm滤膜过滤，得到含CSE的DMEM母液［9］。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与CSE处理 16HBE和MRC⁃5细胞分别使用含10%FBS的DMED和MEM培养基，置于含有5%CO2以及温度37℃的细胞培养箱培养。16HBE细胞使用终浓度为20%的CSE刺激16HBE细胞48 h，收集细胞上清，采用超离的方式分离细胞上清外泌体。……