蓝远强 吴发胜 黄丽珍 梁敏

肝细胞内存在大量内质网，内质网应激(ERS)参与急性肝衰竭(ALF)的发生发展[1-3]。肝细胞生长因子(HGF)对ALF发生后肝脏组织细胞的修复再生具有重要意义[4]。有研究认为ERS可能通过影响HGF延缓ALF，但尚缺乏足够证据[5]，目前临床有关ALF患者ERS与肝星状细胞HGF关系的报道也较为罕见。本研究通过大鼠模型基础实验，探讨ERS与HGF的关系及其相互作用的具体机制。

资料与方法

一、实验试剂

SD大鼠鼠龄3～4 w，体质量为180～240 g。脂多糖(LPS，货号Sigma L2880)和衣霉素(货号MS0013-1MG)均由上海懋康生物科技有限公司提供。D-氨基半乳糖(D-GaIN)由湖北赛搏医药化学品有限公司提供，4-苯基丁酸钠(4-PBA)由美国Sigma公司提供。

二、ALF建模

常规喂养SD大鼠1 w。完成后将60只大鼠随机分为A、B、C三组，每组20只。先通过腹腔注射给予D-氨基半乳糖 400 mg/kg、脂多糖 20 μg/kg。在注射完成1 h后给予A、C组大鼠0.6 mL/kg衣霉素，C组在完成上述操作后再注射4-PBA 500 mg/kg。在注射脂多糖后0 h(T1)、2 h(T2)、8 h(T3)和12 h(T4)时，各组分别处死5只动物，留取尾静脉血，离心取上清，备用。

三、检测方法

采用ELISA法检测血清HGF，试剂盒由南京卡米洛生物工程有限公司提供；检测肝组织HGF mRNA(武汉优博生物技术有限公司)。引物设计见表1。

表1 引物序列

四、RNA慢性病毒载体构建

设计并合成eIF2α-shRNA，另以NC-shRNA为阴性对照，序列分别为5′-GTACAAGAGACCTG-GATAT-3′和5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。两组分别记为eIF2α敲除组和阴性对照组。采用GV248载体，依次进行连接、转化、鉴定及共转染处理，完成后8 h替换为完全培养基，常规条件下继续培养2 d，收集上清液，进行浓缩处理后，再行滴度检验。在病毒感染3 d后收集细胞，提取蛋白，行荧光定量聚合酶链式反应检查，收集结果。……