赵东阳，石 洁，苏茹月，郑丹薇，朱岩昆，马晓光，王少华，李 辉，孙国清，孙定勇

河南省疾病预防控制中心 郑州 450016

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作为一种前沿抗结核药物在结核病一线和二线治疗方案中均发挥重要作用[1]。该药物能有效对抗体内巨噬细胞中滞留的不能被其他的抗结核药物所杀死的结核分枝杆菌。PZA需要在吡嗪酰胺酶(PZase)的作用下转化为有活性的吡嗪酸发挥作用。PZase是由561个核苷酸编码的蛋白。pncA基因突变导致PZase失活，是引起结核分枝杆菌对PZA耐药的主要机制。pncA突变具有高度可变性，且散在分布于开放阅读框及上游基因调控区域[2]。除了pncA基因突变外，编码30S核糖体蛋白S1的基因rpsA突变后，会改变吡嗪酸的结合位点，也可引起PZA耐药[3]。有研究[4]表明panD和结核分枝杆菌PZA的耐药相关。到目前为止，rpsA和panD突变是否引起结核分枝杆菌PZA耐药仍有争议性，因此需要更多实验数据来阐明两者与PZA耐药的关系。

由于PZA只有在低pH值条件下才具有抗菌活性，因此在做PZA药敏测定时需在酸性环境下进行。且PZA药敏测定操作较复杂，实验失败可能性较大，同时结核分枝杆菌生长周期长，常规PZA药敏检测需要2～3周，因此近年来分子诊断成为检测PZA耐药的一种重要工具。本研究对152株耐多药(MDR)结核分枝杆菌菌株进行了PZA药敏测定，同时对pncA、rpsA和panD突变预测PZA耐药性的效能进行了评价。

1 材料与方法

1.1样本来源收集2018年1月至12月于新密市、嵩县、扶沟县、焦作市疾病预防控制中心，中牟县卫生防疫站，邓州市、南阳市、开封市、安阳市结核病防治所，鹤壁市传染病医院就诊的152例MDR肺结核病患者的痰标本，进行痰培养。同时对患者进行问卷调查，将菌株标本和调查问卷集中送至河南省疾病预防控制中心进行后续研究。该项目由河南省疾病预防控制中心医学伦理委员会批准。从病历记录中获取信息。就诊前接受过不规则化疗超过1个月的结核病患者被定义为复治患者。

1.2pncA、rpsA和panD基因突变检测从培养阳性的罗氏培养基上刮取新鲜的培养菌至500 μL TE缓存液中，85 ℃灭活30 min，煮沸5 min后离心待用[5]。取2 μL DNA加入含有引物的PCR预混液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，使用粗提的DNA为模板进行扩增，pncA上游引物5’-AA CAGTTCATCCCGGTTC-3’，下游引物5’-GCGTCAT GGACCCTATATC-3’；rpsA上游引物5’-CGGAG CAACCCAACAATA-3’，下游引物5’-GTGGACAG CAACGACTTC-3’；panD上游引物5’-TCAACGGT TCCGGTCGGCTGCT-3’，下游引物5’-TATCCGC CACTGCTGCACGACCTT-3’。 扩增体系20 μL，PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃10 min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，并与野生型菌株H37Rv序列比较。

1.3Spoligotyping和NTF分析按照文献[5]进行Spoligotyping分析。应用DR区上游引物5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’和下游引物5’ -GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’对抽提的基因组进行PCR扩增，然后将PCR产物与预先包被43条间隔寡核苷酸的膜杂交，根据43个不同间隔区存在情况判读结果。根据结核分枝杆菌NTF区设计上游引物5’-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3’，下游引物5’-TGCCGTTCTCGAAATCTAAACAA-3’[6]；若NTF区域存在IS6110片段插入为现代型，否则为古典型。

1.4PZA药敏及最小抑菌浓度(MIC)测定使用购自美国BD公司的结核分枝杆菌液体培养基(Bactec MIGT 960)培养细菌，加入终浓度为100 mg/L的PZA，7～10 d后读取结果，报告阳性的为耐药菌，阴性的为敏感菌[7]。使用微孔板法进行MIC检测。在96孔板第1列加入含有PZA浓度400 mg/L的pH5.5的7H9液体培养基，倍比稀释，直至倒数第2列PZA浓度为3.13 mg/L。将1个麦氏浓度的结核分枝杆菌稀释100倍后，每孔加入100 μL。37 ℃培养7 d，每孔加入3 μL 体积分数为1%的刃天青和12 μL 体积分数为5% 的Tween-80，继续培养24 h，观察颜色变化。以蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，蓝色孔对应的最低药物浓度为MIC。

1.5数据分析使用SPSS 19.0进行比值比和95%CI的分析来判断不同组别间PZA耐药性是否存在差异。根据标准差计算公式使用MedCalc在线计算工具(https://www.MedCalc.net/)计算灵敏度和特异度的95%CI。

2 结果

2.1不同特征的MDR结核患者PZA耐药分析见表1。152株MDR结核分枝杆菌菌株中有105株PZA耐药，耐药率为69.1%。比较不同特征MDR 结核患者PZA的耐药性发现北京家族更易产生PZA耐药，且现代型菌株对PZA具有更高的耐药频率。

表1 不同特征的MDR结核患者PZA的耐药性分析

2.2pncA、rpsA和panD基因突变情况152株MDR结核分歧杆菌菌株中有102株发生pncA基因突变，突变率为67.1%(102/152)，其中3个为同义突变；82株发生碱基突变(包含3个同义突变)，20株菌发生移码突变，有9种突变为发生在多个菌株的共享突变。有133株PZA药敏结果和pncA测序结果一致；有8个PZA敏感菌株的pncA基因发生了碱基突变，其中3个是同义突变；11株PZA耐药菌株的pncA基因未发生突变。对发生了pncA基因突变的8株PZA敏感菌菌株进行MIC测定，结果见表2。

表2 pncA突变的8株PZA敏感菌的MIC

rpsA和panD基因突变情况见表3。rpsA和panD的启动子区均未发现突变位点，并且大多数rpsA和panD发生突变的PZA耐药菌株均同时伴随着pncA的突变。152株MDR结核分枝杆菌菌株中有76株发生rpsA基因突变，突变率为72.4%。rpsA的突变散在分布，但主要集中在N末端。在rpsA基因357位和532位核苷酸突变的PZA耐药菌株中未检测到pncA突变；rpsA基因636位核苷酸的同义突变为非特异性突变，在68株PZA耐药菌株和35株PZA敏感菌株中均发生了该突变。在47株PZA敏感菌株中未发现panD基因突变。在105株PZA耐药菌株中有2株菌发生panD基因突变，其中1株未检测到pncA的突变。

表3 rpsA和panD基因突变情况

以PZA的药敏表型为参照，使用pncA突变检测PZA耐药的灵敏度为89.52%(95%CI为81.64%～94.39%)，特异度为89.36% (95%CI为76.10%～96.01%)，见表4。rpsA/panD突变与PZA的耐药表型的一致性较差，但rpsA和panD突变与pncA联合后，可将仅用pncA检测PZA耐药的灵敏度提高。

表4 MDR结核分枝杆菌菌株PZA耐药性的效能评价

3 讨论

PZA在MDR结核患者治疗中发挥了重要作用[8]。本研究调查了河南MDR结核患者的PZA耐药情况，结果显示69.1%的MDR结核分枝杆菌菌株对PZA耐药,与重庆地区的耐药率(62.4%)相近[9]，略高于之前的研究结果[10-13]。

有研究[14]认为结核杆菌的基因谱系与PZA的耐药性不存在相关性。本研究结果表明北京型结核分枝杆菌的PZA耐药比例明显高于非北京型，且现代型高于古典型。但由于样本量的欠缺，尚不能认为PZA的耐药性和结核杆菌基因型相关。

不同地区PZA耐药菌株中pncA基因发生突变的比率有所不同，巴西为45.7%[15]，伊朗为70.6%[16]，台湾为75.0%[17]，重庆为88%[9]，瑞典为94.1%[18]。本研究pncA基因突变发生率为67.1%(102/152)。虽然之前文献[2,19-20]报道pncA基因突变与菌株成簇情况有一定关联，由于本研究中纳入菌株较少且主要为北京家族基因型，不能判断这些菌株是否具有成簇性。

与之前的研究[7，12]比较，本研究中的MDR结核分期杆菌菌株rpsA突变频率较高，有72.4%(76/105)PZA耐药的菌株发生rpsA的突变。636位核苷酸在PZA耐药和敏感菌株中均有较高比例的同义突变。但在PZA的敏感株中未发现rpsA的错义或移码突变。本研究发现rpsA基因的突变主要集中于C末端，与之前研究[7,10]相一致。此外rpsA的突变位点中有5个为首次报道，这些rpsA的突变位点对PZA耐药性的影响还需进一步验证。本研究结果表明PZA耐药菌株中有2株发生panD基因突变，有1株为pncA野生型耐药菌株。

本研究PZA的耐药表型和pncA突变序列相一致的有89.52%。8株菌的pncA基因发生突变但其药敏结果显示对PZA敏感(其中3株为同义突变)，有8株pncA野生型分离株却表现出PZA耐药。作者对pncA发生突变的PZA敏感株进行了MIC测定，除了3株发生同义突变的菌株，其余5株pncA发生突变菌株均表现为PZA低水平耐药(12.5 mg/L

本研究联合使用3种基因测序结果评估PZA耐药性的灵敏度和特异度分别为92.38%和89.36%，与其他研究相一致[23]。

纳入的样本量较少是本研究主要限制，并且所有的菌株均来自同一地区也降低了结果的代表性，日后将收集更多样本进行研究。

综上所述，通过对河南省MDR结核患者的pncA、rpsA和panD基因突变情况进行检测和分析，可快速、准确地预测PZA耐药性。