梁诗豪，王 倩，崔趁趁，李艳如，张翠莲，冯 若

1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学系 郑州 450001 2)河南省人民医院生殖医学中心 郑州 450003

不孕不育困扰着许多已婚夫妇，辅助生殖技术的发展在一定程度上缓解了这一难题。然而，辅助生殖技术成功与否也受到许多因素制约，其中精准的胚胎评级就是一个重要的影响因素。通常，精子与卵子完成体外受精后，需在规定的时间内运用显微镜观察胚胎发育状态，综合评估胚胎的发育潜力，包括胚胎的形态学特征诸如原核消失时间、多核、卵裂情况、卵裂细胞数及碎片情况，以及囊胚评级诸如囊胚扩张程度、内细胞团及滋养层的状态等[1-7]；也可利用时差成像技术实时观察胚胎的发育状态，了解胚胎发育过程[8]，即将胚胎置于封闭稳定的环境下观察并对其进行形态学评估[9]；进而制定胚胎移植方案。透明带(zona pellucida,ZP) 硬度作为衡量胚胎质量的指标之一，是影响种植率和妊娠率的重要因素。临床上主要通过激光辅助孵化技术来降低ZP硬度，改善临床结局。ZP硬度与患者年龄关系密切，通常来自高龄患者的胚胎表面ZP硬度较大。然而，并非所有来自高龄患者的胚胎表面ZP硬度都异常增高，部分来自年轻患者的胚胎表面ZP硬度也有可能过高。由于临床上缺乏评价胚胎表面硬度的物理参量，因此无法精准决策是否需要辅助孵化。

本研究自行设计了一种可模拟测量胚胎模型表面张力和ZP硬度的方法，通过该方法可以探究无创测量活胚胎表面张力的可能，报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料测量装置包括分度值为0.1 g的电子秤，带有压缩刻度的钻台，自制的亚克力压缩板，5 cm直径充满水的胚胎模型。整体示意图见图1。胚胎模型为橡胶气球，充满水后用手轻握悬空时接近球体，放置在地面上，在地心引力的作用下正视略偏椭圆，俯视为正圆。

1.2制作数据表制作胚胎模型压缩数据表(表1)，包括压缩距离I(mm)，秤读数m(g)，作用力F(N)，实测压缩部位半径β压(cm)，受力面积A压(cm2)和接触面压强P压(Pa)。

1.3测量步骤把钻台和亚克力压缩板组装好，放置好水槽，使压缩版悬空于液面上；放松压缩板的固定螺丝，手动调整，下压压缩板使其接触水面，至其四周能同时接触水面时旋紧固定螺丝并使压缩版保持水平；撤去水槽，置电子秤于钻台底座上，秤上放置胚胎模型。

图1 装置整体示意图

1.4胚胎模型表面压强的计算以压缩距离I为X，以压强P压为Y，拟合线性回归模型，根据模型计算I=0时P压。

1.5胚胎模型表面张力系数的计算推导拉普拉斯公式(式1)到合适的球面形式(式2)。把胚胎模型I=0时的半径R和推算出的P压同时代入式2，求出胚胎模型表面的张力系数γ压=γ。

(1)

当球形胚胎模型未压缩时半径为R，即R1=R2=R，所以式1可以化简为式2：

(2)

2 结果

2.1各指标实测结果见表1。

表1 自制压力测量仪测量胚胎模型表面张力相关的参数值(n=3)

2.2胚胎模型未压缩时的表面压强根据表1数据拟合线性回归模型，回归方程为P压=71.69I+1 558.4，见图2。据此计算出，当I=0时，P压=1 558.4 Pa。将P=1 558.4 Pa、R=0.025 m代入式4，得到γ压=19.48 N/m。误差线为P压的正负标准差。

图2 I和P压的关系

3 讨论

目前，细胞表面张力的测量方法均不适用于胚胎表面张力测量。离心技术可用于检测细胞表面张力，其原理是：选用密度介于细胞核与细胞油脂之间的离心液；由于细胞内部油脂和细胞核在离心液中所受离心力不同而分布在细胞的两级，把细胞拉伸成哑铃状，借助两级的拉力差以及中间细部的周长，计算细胞表面张力。该方法使细胞过度拉长，过度的形变可造成细胞失活。另一种方法是使用比细胞直径小的玻璃细管吹吸细胞使其形变，利用拉普拉斯原理求出张力系数[10]，但该技术要求细胞的表面张力恒定。震动液滴实验也可用于测量细胞表面张力，其原理是：把细胞视为一个液滴，当细胞通过一个比其直径细的微管而从另一端释放时，细胞会来回震动，通过震动的时间周期和细胞质量推算其表面张力。该技术有一定难度且安全性较差。测量震动周期取决于微管直径，直径过大则细胞震动次数过少甚至不震动，直径过小又会伤及细胞，细胞表面物质可能受损，因而永久变形。亦有研究[11]在细胞表面安装分子探针，分子探针在细胞被拉伸和不被拉伸的情况下会发出不同波长的光，通过不同波长光强度的比判断张力。此方法虽然可以进行精确测量，但是分子探针的载入改变了细胞表面化学物质，可能会对细胞活性造成影响。也有学者[12]对胚胎表面ZP进行定强激光照射，借助打穿时间对ZP硬度进行评估，但强激光照射可能会损伤胚胎。

本研究建立的测量方法，压缩压强关系图符合正常弹性物体被压缩的规律，即胚胎模型表面抵抗压强随着压缩距离的增加而增加。该表面张力测量仪为直接测量仪器，在其压缩胚胎模型时，得出的值经过电子秤微量测力，图表统计软件对散点图的标定，在散点图中规划符合其排布的函数直线，沿趋势判断出图中的纵轴截距，使用拉普拉斯公式利用截距和未压缩时的半径就可计算出张力值，技术操作简便，产生误差的操作少。

实验中误差的产生主要出现在秤读数m和实测压缩部位半径β压的取值。电子秤对于压力的变化敏感，由于压缩板的压缩距离由人手工控制，所以m会有波动，造成图2误差线的增高。β压取决于压缩面直径的测值。钻台上有刻度尺，最小分度值为1 mm，微小的偏差不可避免，对β压读数有整体性的影响，而小于1 mm的微动对于压缩面直径的影响就比较可观。两项偏差共同造成了图2中的数据点不在一条平滑的线上。

本研究所设计的张力测量仪的测量方式是无损性的，胚胎模型只是被压缩板进行简单的物理性挤压，没有实质性的穿透损伤，也无需光学照射，可以减少因此造成的损伤，符合医学中心原则，即降低风险、降低伤害、不产废料，适用于临床试验。本装置可以被微缩化处理：缩小亚克力压缩板，缩小电子秤，增加微动装置。经过缩微化处理后，把胚胎模型替换成实际的早期胚胎和使用显微镜观察压缩过程，就可以评估早期胚胎的ZP硬度，测值不大于限值可视为正常，大于限值可视为过硬。利用该装置可以通过测定胚胎表面张力来预估ZP硬度，从而辅助临床判断胚胎质量。

致谢：李新建教授，郑州大学物理学院，对文章中实验方法的可行性给予了指导。