宋 莉，张 孟，李 悦，郝泽壮，丁长虹，赵 妍，周长龙，段明华

微生物污染了药品，会将药品中的主要活性成分破坏，使得药品失去作用效果并产生不良反应。所以，对药品进行微生物限度检查是控制和监测药品质量的重要指标[1]。《中国药典》规定了控制药品中存在的微生物范围：霉菌、酵母菌、细菌和控制菌[2-3]。

成团泛菌，属肠杆菌，革兰阴性菌，黄色黏性[4]。可从水果、植物或种子中分离获得[5-6]。 在临床上，由成团泛菌感染引起的疾病称为成团泛菌败血症，此证为急症，病情严重，临床表现为畏寒，高热，病人体温可达到39℃以上[7]。

截至目前，有一系列方法可用于菌株鉴定，主要包括：菌落培养后的形态学观察、革兰染色观察和生化反应判定。这些方法繁琐，耗时长，且只能对菌株进行初步鉴定。而且，确定菌株仅仅依靠一种鉴定方法是远远不够的，必须结合几种方法对菌株进行鉴定，才能得出相对准确的结论。因此，从不同角度和仪器自动化层面对菌株进行鉴定，并综合不同的鉴定方法对菌株进行定性判定成为控制药品质量的重要环节。

本实验从3个角度对成团泛菌进行了鉴别，应用BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪对成团泛菌进行种属鉴别[8-9]，微生物鉴定飞行时间质谱仪对成团泛菌中的蛋白质进行鉴别[10-13]，共聚焦显微拉曼色谱仪对成团泛菌表面物质进行扫描鉴别[14-15]。通过3个层面的鉴别，以期实现对成团泛菌科学准确的定性，从而控制药品质量，保证人民用药安全。

1 材料与方法

1.1 仪器 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：20201222）；电热恒温培养箱（扬州慧科电子有限公司，型号：GHP-9162）；微生物鉴定及药敏分析系统（美国BD公司，型号：BD Phoenix M50）；微生物飞行时间质谱仪（江苏天瑞仪器股份有限公司福建公司，型号：JJF1528-2015）；共聚焦显微拉曼光谱仪（RENISHAWRinVia Raman Microscop,型号：Gloucestershire,UK）。

1.2 培养方法

1.2.1 成团泛菌培养 药品在进行微生物限度检测时，在检测目标菌沙门菌的培养板中，发现在XLD（木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂）培养基中有黄色黏性菌落生长，与沙门菌菌落形态判定不一致，所以怀疑药品中存在其他微生物，为了药品的安全性，对该可疑菌落进行进一步纯化与鉴定。

在无菌超净工作台内，采用接种针挑取单颗菌落，在XLD培养基平皿中划线，然后放置于（36±1）℃恒温培养箱中，培养24 h，观察结果。根据观察结果进行初步判断，然后应用BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪对该菌的种属进行鉴别，应用飞行时间质谱仪对细菌的蛋白质进行鉴别，应用共聚焦显微拉曼光谱仪对菌落拉曼光谱进行扫描鉴别。

1.3 鉴定方法

1.3.1 BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪鉴定可疑菌落 根据进行的革兰染色结果，确定该菌为革兰阴性菌，所以在进行细菌鉴定时，选取革兰阴性板卡进行实验。从XLD培养基上挑取单一菌落，放置于鉴定肉汤管，配制菌悬液，混合均匀。应用Phoenix比浊仪监测菌浓度，使得空白鉴定肉汤管最终菌浓度为0.5～0.6麦氏单位，60 min内使用。取革兰阴性板卡，使用无荧光的标记笔在板卡上进行标记，将板卡放置于加样盘上，将鉴定菌悬液连续倾倒于板卡内，使菌悬液充满每一个反应孔。用密封盖将板卡封住，将加样完成后的板卡在30 min内放入BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪进行检测。应用鉴定板转移器进行鉴定板转移，并保持直立状态。

1.3.2 JJF1528-2015飞行时间质谱仪鉴定成团泛菌（1）基质液配制(1.0 ml)称取15.0 mgα-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）放置于体积为1.5 ml的离心管中，向其中依次加入乙腈500μl、去离子水475μl和三氟乙酸25μl。涡旋震荡2～3 min，常温或置于4℃保存，有效期为1～2 w。（2）70%甲酸配制(10.0 ml)：吸取7 ml甲酸放置于体积为15.0 ml的离心管中，向其中加入蒸馏水3.0 ml，充分混匀，常温或置于4℃，避光保存。（3）波谱采集：用10.0μl规格的移液枪头挑取菌体，适量即可。均匀涂抹在靶点内，向其中滴加70%甲酸1.0μl，晾干。再滴加基质液1.0μl覆盖样品，晾干后进行图谱采集。

1.3.3 成团泛菌拉曼光谱扫描 （1）白光成像：设置共聚焦显微拉曼光谱仪(RENISHAWRinVia Raman Microscop,Gloucestershire,UK)的参数，白光成像过程中，需要调整显微镜放大倍数，以获得一个较清晰的视野[16]。（2）拉曼光谱扫描：将光谱扫描设置为静态扫描，扫描波长785 nm，扫描的光谱中心位置为500 cm-1。获得的扫描图谱如果没有光谱峰，说明设置的laser power较弱；如果出现了虚线光谱峰，说明设置的laser power过高，信号已经饱和。在设定的参数条件下，对成团泛菌进行静态拉曼光谱扫描[17]。

1.4 统计学方法 应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，采用t检验及单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌纯化培养 在XLD培养基中对可疑菌落进行纯化培养，结果见图1，菌落呈黄色，有粘性。

2.2 BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪鉴定BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析仪在分析细菌对不同生化底物所产生的发荧光的物质，通过读数器测定荧光强度来判定细菌胞外酶；读取数值后，自动将所测取的数据与存储在硬盘中的菌种资料库标准菌生物模型相比较，由电脑分析得出的结果做出鉴定。鉴定结果见表1，根据鉴定结果，将可疑菌落定性为成团泛菌。

2.3 微生物飞行时间质谱 未知微生物通过它们各自的峰列表与数据库的比较来鉴定。依据确定的质量数和它们的强度的相关性生成一个匹配值，这个值用来对结果进行排序。

表1 成团泛菌生化特性检测

应用JJF1528-2015飞行时间质谱仪对成团泛菌进行进一步鉴定，鉴定结果见图2。综合分析，并与数据库进行比对，鉴定结论为成团泛菌，仪器设备给定分数1.5以上为鉴定成功，此次检定结果得分为1.97分，鉴定结果可信。

图1 XLD培养基中菌落纯化培养

图2 成团泛菌飞行时间质谱仪鉴定质谱

2.4 拉曼光谱扫描

2.4.1 成团泛菌白光成像 对空白培养基和成团泛菌分别进行白光成像，见图3（A、B），A为空白培养基白光成像图，B为成团泛菌白光成像图 。

2.4.2 成团泛菌拉曼光谱扫描 在设定的扫描参数下，对空白培养基和成团泛菌进行静态扫描，获得单一成分拉曼特征指纹图谱。可以看出，成团泛菌的拉曼特征峰主要集中在100～1100 cm-1光谱范围内，在970 cm-1，1010 cm-1，附近处均出现明显的特征峰，见图3（C、D）。

3 讨论

以往许多研究表明，通过外观观察、生化反应或单一的鉴别方法对可疑菌落得出的鉴别结论，可能会出现误差甚至错误，从而影响对微生物的判定，影响药品安全性。

在本实验研究中，首先对可疑菌落在XLD培养基中进行了纯化培养，应用BD Phoenix M50细菌鉴定药敏分析对菌落进行了生物化学鉴定，初步鉴定为成团泛菌。然后应用飞行时间质谱仪，对细菌内的蛋白质进行峰归属，进一步确定其为成团泛菌。最后应用共聚焦显微拉曼光谱仪，对成团泛菌表面物质进行了拉曼光谱扫描，获得拉曼特征吸收峰。

药品进行微生物检测过程中[18-19]，必须证明使用的试剂对微生物无毒性。同时，在操作过程中，必须控制检验过程染菌，否则影响结果判定。

细菌鉴定药敏分析方法对操作步骤要求严格，菌悬液配制的浓度以及应用时限都有严格规定。这样就对检验人员的业务素养和能力提出了一定的要求，该方法实现了对菌株种属的鉴定[20-21]。

微生物飞行时间质谱在检测过程中，菌株涂抹不可过厚，否则不能真实反应检测结果。该方法对菌株中的蛋白质进行峰归属检测，检测物质的分子量范围较大，同时扫描速度快[22-23]。

图3 成团泛菌拉曼光谱扫描

拉曼光谱技术在建立成团泛菌拉曼特征指纹图谱的过程中，将拉曼色谱峰作为鉴别不同菌株的指标。该方法能够科学、细致、准确地实现菌株的快速鉴别[24-25]。

综上所述，本实验从通过3种不同的方法由表及里对可疑菌落进行了准确科学的判定，得出了正确的结论，有利于药品安全和人民用药健康。