黄珊珊,宋秀宇,徐巧丽,饶慧华,张加勤

变异链球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是口腔主要致龋菌之一，至今无特效药根治龋齿。变异链球菌感染口腔后粘附牙齿表面形成生物膜，并在其保护下分解糖类，产生酸代谢产物，引发龋齿[1]。而在致龋的过程中，变异链球菌需克服各种生存环境的改变生长，这主要依赖原核生物信号传导双组份系统(two-component system,TCS)的调控作用[2]。TCS可参与调节细菌的多种生物学作用，如细胞壁形成、粘附、毒力、氧化应激反应等[3]。S.mutansUA159可编码14 种TCSs，VicRK双组分系统为其中之一，与细菌毒力相关，VicK为组氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)，VicR为可与DNA结合的转录因子应答调节蛋白(Response Regulator，RR)[4]。

HATPase_c结构域(CA区)是VicK中具有ATP酶活性的特征性区域，显示激酶活性，是细菌激酶磷酸化的始动环节。以往人们对VicK的研究大多是敲除整个vicK基因，没有单独对HATPase_c结构域的ATP激酶活性进行研究。为研究vicK基因HATPase_c结构域中ATP结合位点对变异链球菌的影响，本研究采用同源重组的方法敲除vicK基因ATP结合位点核心区域(命名为ΔvicKATP基因)，验证其蛋白ATP激酶活性，构建补偿菌株，观察vicK基因ATP结合位点对变异链球菌生长、产酸耐酸、胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)和生物膜形成能力等生物学功能的影响。

1 材料和方法

1.1菌株和质粒 变异链球菌UA159由第四军医大馈赠；质粒pCrePA和pIB107由堪萨斯大学医学中心 Biswas Indranil 教授惠赠；pET-His、E.coliDH5、E.coliBL21(DE3)、pET-21(b)、pDLP为前期实验构建。

1.3实验步骤

1.3.1vicK基因HATPase_c结构域预测 利用expasy、phyre2和软件TargetATPsite[5]预测HATPase_c结构域和其中的ATP结合位点，设计引物敲除vicK基因HATPase_c结构域ATP结合位点的核心区域。

1.3.2vicKATP突变同源重组载体构建 以变异链球菌UA159基因组DNA为……