董琳 史锐

P21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CDKI)，不仅通过调控细胞周期维持细胞的生长和增殖，还参与细胞凋亡、细胞衰老等过程[1-2]。它对细胞凋亡的调控起着双刃剑作用，不仅可通过细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和具有BH1-4保守结构区域调节因子(Bcl-2等)抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，又可通过上调具有BH1-3结构区域调节因子(促凋亡蛋白Bax等)或激活TNF家族死亡受体(TRAIL)促进细胞凋亡[3-4]。因此它具有多样的生物学功能。近期研究发现，G1期检测点的CDK抑制因子p21促进许多恶性肿瘤的发生发展。并且当p21缺失时可以促进肿瘤耐药[5]。为了深入研究p21蛋白功能的分子机制及其与肿瘤的关系，急需建立稳定沉默p21的细胞模型。本研究拟使用pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro慢病毒载体构建pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21重组质粒，进行稳定沉默p21的人肺腺癌H460细胞模型的构建，并检测细胞凋亡相关指标Bax和Bcl-2及细胞增殖情况，为进一步探索p21的生物学作用机制奠定基础。

资料与方法

一、主要试剂和细胞

Prestained Protein Marker购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司 ，质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN 公司，HiGene 细胞转染试剂购自北京普利莱基因技术有限公司，胎牛血清及DMEM细胞培养液均购自中国Clark公司，CCK8试剂盒购自上海佛元生物科技有限公司，pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro慢病毒载体、pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21重组质粒、慢病毒包装骨架PCMV-dr8.9dvpr416、PCMV-VSV-G417均购自上海生工公司，p21、Bax、Bcl-2、β-actin抗体均购自美国CST公司，人胚肾293T细胞、人肺腺癌H460细胞为本实验室自存。

二、细胞培育

将293T细胞和H460细胞用8%的胎牛血清，在标准培养箱中进行培养(37℃，5% CO2)，及时传代，调整状态备用。

三、质……

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