张桂仙，高 丽，李正伦，张 米，谢 祺

云南省传染病医院检验科，云南昆明 650301

非结核分枝杆菌(NTM)是指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌[1]，机会性感染是此类菌的显著特点。HIV感染者免疫功能低下，常合并各种机会性感染，合并NTM感染就是其中常见的合并感染之一，且已成为HIV感染者发病、就诊、入院和死亡的重要原因之一[2]，快速检测NTM有助于早期精准治疗HIV合并NTM感染患者。基因芯片技术是目前较为可靠的NTM鉴定技术，此方法可较精确地鉴别多种NTM，并可以排除卡介苗、结核分枝杆菌的影响[3]。本研究对本院2012年9月至2019年12月使用基因芯片技术进行NTM菌种鉴定的HIV感染者进行分析，探讨适合本院NTM菌株鉴定的方法，以及HIV合并NTM感染的菌种分布和免疫特征。

1 资料与方法

1.1一般资料 将本院2012年9月至2019年12月收治的90例HIV合并NTM感染患者作为研究对象，分离NTM菌株90株。

1.2仪器与试剂 NTM菌种鉴定试剂由成都博奥晶芯生物有限公司生产；检测仪器包括晶芯®ExtractorTM36核酸快速提取仪、BioMixerTMⅡ芯片杂交仪、Slide WasherTM8芯片洗干仪、晶芯®LuxScanTM10K-B微阵芯片扫描仪、美国ABI 7300 PCR扩增仪。CD4+T淋巴细胞检测试剂由美国Becton-Dickinson公司生产；检测仪器为美国Becton-Dickinson公司生产的FACSCalibur流式细胞仪。

1.3方法

1.3.1核酸提取 取1 mL菌悬液置入洁净离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入1 mL生理盐水，涡旋振荡混合均匀后12 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入80 μL核酸提取液，涡旋振荡混合均匀后转入核酸提取管中，将核酸提取管置于晶芯®ExtractorTM36核酸快速提取仪上振荡5 min；然后将核酸提取管置于95 ℃金属浴5 min，5 000 r/min离心1 min。

1.3.2核酸扩增 取出PCR扩增试剂自然解冻，混匀后分别取18 μL加入每支扩增管中，然后加入2 μL核酸提取管中的核酸溶液，将扩增管放入PCR扩增仪中进行扩增。

1.3.3芯片杂交 取出杂交缓冲液，50 ℃加热使其完全融化，充分混匀；将PCR产物置于PCR仪中95 ℃变性5 min；取扩增管加9 μL杂交缓冲液，再加入PCR产物6 μL，充分混匀，取杂交反应混合物13.5 μL加入杂交芯片加样孔中，置于BioMixerTMⅡ芯片杂交仪中50 ℃杂交2 h。

1.3.4洗涤、干燥及扫描 取出洗液原液20×SSC、10%SDS分别配制。洗液Ⅰ：依次将20×SSC(50 mL)、蒸馏水(440 mL)、10%SDS(10 mL)混合。洗液Ⅱ：将20×SSC(10 mL)与蒸馏水990 mL混合。开启Slide WasherTM8芯片洗干仪进行洗涤甩干，开启晶芯®LuxScanTM10K-B微阵芯片扫描仪进行结核分枝杆菌菌种鉴定检测，采用芯片判别系统进行结果判读。

1.3.5CD4+T淋巴细胞检测 使用含有乙二胺四乙酸二钾或乙二胺四乙酸三钾的真空采血管采集抗凝血标本2 mL。取20 μL抗体(CD4/CD3/CD8/CD45)加入检测管中，并加入患者标本50 μL，混匀避光15 min，之后加450 μL红细胞裂解液混匀，避光15 min后，打开FACSCalibur流式细胞仪，运行程序，进行CD4+T淋巴细胞计数。

1.4统计学处理 采用Excel2007统计软件进行数据库建立和数据录入，采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同年龄HIV合并NTM感染患者性别情况比较 90例HIV合并NTM感染患者中男69例(76.67%)，女21例(23.33%)。≥70岁年龄组男女比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，其余各年龄组男性明显多于女性，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同年龄HIV合并NTM感染患者性别情况比较(n=90)

2.2NTM菌种鉴定结果 90株NTM经基因芯片技术检测为鸟分枝杆菌73株[81.11%(73/90)]，堪萨斯分枝杆菌6株[6.67%(6/90)]，龟脓分枝杆菌4株[4.44%(4/90)]，戈登分枝杆菌2株[2.22%(2/90)]，偶然分枝杆菌2株[2.22%(2/90)]，瘰疬分枝杆菌2株[2.22%(2/90)]，浅黄分枝杆菌1株[1.11%(1/90)]。在标本类型中，痰液最多，占67.78%；粪便次之，占16.67%；灌洗液再次之，占3.33%；骨髓、尿液、腹水、血液、脑脊液标本均占1.11%。见表2。

表2 90株NTM标本类型及菌种分布情况

2.3CD4+T淋巴细胞检测结果 CD4+T淋巴细胞<50个/μL的患者多为鸟分枝杆菌感染，占总人数的42.22%；堪萨斯分枝杆菌占4.44%。CD4+T淋巴细胞为50～<200个/μL的患者感染鸟分枝杆菌也居多，占总人数的28.89%。见表3。

表3 CD4+T淋巴细胞检测结果

3 讨 论

近年来，随着HIV感染发病率的增加，HIV合并NTM感染的发病率也呈现快速上升趋势[4-5]，严重威胁着HIV感染者的健康。由于NTM感染患者的相关临床症状、体征及影像学表现等缺乏典型性，导致其容易被误诊为结核分枝杆菌感染，且病死率高[6]。罗氏培养是结核病诊断的金标准，但用时较长，不利于早期快速诊断；萋尼抗酸染色具有快速、经济、简便等优点，且报告及时，当天可取，但抗酸染色阳性是分枝杆菌属独有的特点，也不能作为结核分枝杆菌鉴定的绝对指征，只能作为初步提示，故临床急需一种快速、经济、高效的检测方法。基因芯片技术是近几年发展起来的一种新方法，是目前较为可靠的分子层面的NTM鉴定技术，此方法可较为精确地鉴别多种NTM，可用于结核病和非结核病的辅助诊断[7]。

本研究检测的90例患者中，男性明显多于女性(69/21,3.29∶1.00)，这可能与就诊的患者以男性为主有关；30～<60岁中青年患者占较大比例(82.22%)，说明中青年HIV感染者是NTM的高发人群，发病人群趋于年轻化，已成为HIV合并NTM感染的高危人群。检测的标本类型主要以痰液为主67.78%(61/90)，HIV合并NTM感染临床上以肺部感染最常见，这也是本研究中检出NTM的标本中痰液标本所占比例较高的原因；粪便标本次之，占16.67%(15/90)，肠道感染较肺部以外的其他部位感染更常见，并且均为鸟分枝杆菌感染，其他肺外标本也有检出NTM，但所占比例较低。本研究发现HIV合并NTM感染中，最多见的是鸟分枝杆菌感染[81.11%(73/90)]，其次是堪萨斯分枝杆菌感染[6.67%(6/90)]。在《伯杰细菌鉴定手册》中，鸟分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌均属于缓慢生长分枝杆菌。在临床治疗上，鸟分枝杆菌感染需要抗菌药物治疗，治疗时间长而且任务艰巨，堪萨斯分枝杆菌感染在治疗效果上最好[8]，因此，临床非常急需能快速、准确鉴定出NTM的方法，以利于临床医师及时对患者确诊，并采取针对性的治疗方案。本院现使用的基因芯片菌种鉴定技术可检测17种分枝杆菌，包括结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、金色分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、不产色分枝杆菌、龟脓分枝杆菌等。各种体液标本直接涂片，经萋尼抗酸染色法检测阳性或分枝杆菌培养阳性的标本均可采用基因芯片技术进行鉴定，该技术从标本采集到得出结果仅需2 d，大大缩短了检测时间[9]。

艾滋病(AIDS)又称获得性免疫缺陷综合征，是一种危害极大的传染病，由HIV感染引起。CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞，HIV感染人体后，出现CD4+T淋巴细胞进行性减少，细胞免疫功能受损[10]，机体免疫力降低，免疫细胞亚群异常活化，诱导机体各器官或系统损伤，最终由于继发感染导致患者死亡[11-12]。NTM被认为是HIV感染者常见的机会性感染病原体，尤其是CD4+T 淋巴细胞<50个/μL的患者更容易合并NTM感染[13]，鸟分枝杆菌感染通常发生于CD4+T 淋巴细胞<50个/μL的HIV感染者中[14]。本研究中CD4+T 淋巴细胞<50个/μL的患者感染鸟分枝杆菌最多，占总人数的42.22%；CD4+T淋巴细胞为50～<100个/μL的患者感染鸟分枝杆菌也居多，占总人数的15.56%；CD4+T淋巴细胞为100～<200个/μL的患者感染鸟分枝杆菌再次之，占总人数的13.33%；CD4+T淋巴细胞≥200个/μL的患者感染鸟分枝杆菌占总人数的10.00%。由此可见，随着HIV感染者免疫力降低，感染鸟分枝杆菌的概率增加。早诊断和早治疗可以修复HIV感染者受损的免疫功能，减少或避免机会性感染的发生，降低治疗成本，提高生活质量。

最常见的NTM是鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌，而NTM感染菌种和流行率随地理位置变化而变化[15]。本院治疗的HIV合并NTM感染患者中，最多见的是鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌及浅黄分枝杆菌，在菌种和流行率上有一些特征。HIV感染率上升也促进了NTM感染率的升高，从而使人们越来越重视HIV合并NTM感染，NTM感染正在成为HIV感染患者发生肺内外疾病的重要因素，能够早期识别并治疗NTM感染引起的疾病，有利于降低HIV合并NTM感染的发病率和病死率，减轻社会经济负担[16]。

鸟分枝杆菌是本院HIV合并NTM感染的主要菌种。基因芯片技术能够快速对NTM进行鉴定，是值得推广的检测NTM感染的方法。