李 欢，韩素桂，董宇曦

河北省唐山市人民医院检验科，河北唐山 063001

乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝癌是我国常见的四大恶性肿瘤之一，病死率为10%左右，具有进展快、预后差、侵袭性强的特点。HBV相关原发性肝癌的发病机制与感染HBV、食用黄曲霉素污染的食物、酗酒及饮用蓝绿藻毒素污染的水源有关[1]，由于其发病速度比较快，大多数患者在就诊时已经发生了癌细胞的转移，发展进程已经进入中期和晚期，因而很难进行有效的治疗，所以早期的诊断和预防非常重要[2-3]。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是来源于T淋巴细胞的细胞因子，它能影响肿瘤细胞和单核-巨噬细胞的趋化、游走，在促进恶性肿瘤细胞浸润和转移方面发挥着重要的作用[4]。高尔基体糖蛋白73(GP73)是一种与HBV相关原发性肝癌关系密切的高尔基跨膜糖蛋白，在正常的肝脏组织中表达较少，甚至不表达，在发生病变的肝细胞中水平较高。有研究表明，GP73是一个具有很大潜在价值的HBV相关原发性肝癌标志物，具有较高的灵敏度和特异度[5-6]。维生素K缺乏或拮抗诱导的异常蛋白Ⅱ(VPIKA-Ⅱ)中含有γ-羧基谷氨酸结构，当该结构不完全羧化时，人体的凝血功能会发生异常，在HBV相关原发性肝癌中呈现高表达[7]。本研究分析了HBV相关原发性肝癌患者外周血MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ的表达及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年3月至2020年4月本院收治的72例HBV相关原发性肝癌患者纳入HBV相关原发性肝癌组，其中男38例，女34例；年龄46～75岁，平均(63.68±7.57)岁；病程2～5年，平均(3.68±1.07)年；无淋巴结转移32例，有淋巴结转移40例；按TNM分期标准，分为Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期38例，按肿瘤最大径分为≤5 cm 36例，>5 cm 36例；按肿瘤数量分为≤2个35例，>2个37例。HBV相关原发性肝癌组纳入标准：符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》中的诊断标准[8]；经病理学、影像学确诊为HBV相关原发性肝癌；1个月内未进行过任何抗癌治疗。选择在本院进行健康体检的72例志愿者纳入健康对照组，其中男35例，女37例；年龄41～78岁，平均(62.63±11.47)岁。选择72例无HBV感染的原发性肝癌患者纳入无HBV感染原发性肝癌组，其中男36例，女36例；年龄40～76岁，平均(61.05±11.15)岁；病程2～4年，平均(3.16±0.64)年。所有研究对象排除标准：丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒感染；患有酒精性肝病、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病、药物性肝病和重度脂肪肝；有转移性肝癌和其他肿瘤；心、肺、肝、肾功能不全；孕妇及哺乳期女性；有消化道出血等并发症。3组研究对象的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均自愿参与本研究，并签署知情同意书，本研究经过本院医学伦理委员会批准后进行。

1.2方法

1.2.1HBV检测方法 采用一次性无菌注射器采集所有研究对象2 mL静脉血置入无菌的干燥试管中，在25 ℃环境下放置60 min，4 000 r/min离心5 min，抽取上层血清，将其转移至2 mL的灭菌离心管中，用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，再配上PCR反应液、耐热的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸单体等成分来检测HBV，将上清液放入离心机中1 min，按顺序放入扩增仪微孔中，设计循环条件为93 ℃45 s 10个循环，然后读取结果，结果>103copy/mL为阳性。

1.2.2MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平检测 所有研究对象空腹状态下，采集3 mL静脉血，离心半径13.5 cm，3 000 r/min离心5 min。采用酶联免疫吸附试验检测MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平，取50 mmol/L的碳酸盐缓冲液对MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73进行稀释，加入聚苯乙烯的反应孔中，再进行加盖处理，在4 ℃环境下等待24 h，第2天将其洗涤3次，抛干，在每个反应孔中均加入pH值为7.4、浓度为0.02 mol/L的Tris-HCl缓冲液，再次在42 ℃环境下等待60 min，将液体移除并抛干，在每个反应孔中加入0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸橼酸混匀，并且加入0.1 mL的领苯二胺，遮光处理20 min，再次加入0.1 mol/L的Na2HPO4，终止反应，再使用专业的曲线制作软件，在波长450 nm酶标仪上读取各孔的吸光度(A)值，以MIF水平为横坐标，A值为纵坐标，最后得出MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平。

2 结 果

2.13组研究对象MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较 与健康对照组比较，无HBV感染原发性肝癌组、HBV相关原发性肝癌组MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与无HBV感染原发性肝癌组比较，HBV相关原发性肝癌组MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2有无淋巴结转移HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较 HBV相关原发性肝癌组中，与无淋巴结转移的患者比较，有淋巴结转移的患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 3组研究对象MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较

表2 有无淋巴结转移HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较

2.3不同TNM分期HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较 HBV相关原发性肝癌组中， 与Ⅰ～Ⅱ期患者比较，Ⅲ～Ⅳ期患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同TNM分期HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较

2.4不同肿瘤最大径HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较 HBV相关原发性肝癌组中，与肿瘤最大径≤5 cm的患者比较，肿瘤最大径>5 cm的患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同肿瘤最大径HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较

2.5不同肿瘤数量HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较 HBV相关原发性肝癌组中，与肿瘤数量≤2个患者比较，肿瘤数量>2个患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 不同肿瘤数量HBV相关原发性肝癌组患者MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比较

2.6HBV相关原发性肝癌患者中MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ的相关性 HBV相关原发性肝癌患者中，MIF与GP73呈正相关(r=0.240，P=0.042)；MIF与VPIKA-Ⅱ呈正相关(r=0.368，P=0.002)；GP73与VPIKA-Ⅱ呈正相关(r=0.240，P=0.042)。

3 讨 论

HBV相关原发性肝癌是在肝细胞或者肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，近年来，我国HBV相关原发性肝癌的发生率和病死率逐年上升，严重危害人们健康[9-10]。HBV相关原发性肝癌的发病机制与亚硝胺类、偶氮芥类、有机氯农药、酒精等化学物质有关，同时，肝小胆管中感染华支睾吸虫刺激胆管上皮增生，也是导致HBV相关原发性肝癌发生的原因之一[11]。HBV相关原发性肝癌的发病比较隐匿，早期没有明显的症状，被发现时大多数患者的病情已经进入中期和晚期，因此，临床上容易漏诊和误诊[12]。本研究分析了外周血MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平在HBV相关原发性肝癌中的表达及意义。

MIF是由下丘脑控制的多功能细胞因子，主要由T细胞分泌，此外，许多组织细胞能够产生MIF，从而促成各种炎症性疾病的出现，影响肿瘤细胞和单核巨噬细胞的趋化和游走[13-14]，在炎性反应和肿瘤生长中发挥着双重效应，是调控HBV相关原发性肝癌发生的因子，同时也是抵抗肿瘤免疫防御系统和应激反应系统的因子，可有效地反映HBV相关原发性肝癌的恶性程度。有研究表明，MIF参与了血管生成，促进了肿瘤的生长和转移，可抑制自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，因此，MIF在HBV相关原发性肝癌患者中水平高于健康人群[15-17]。本研究显示，MIF在HBV相关原发性肝癌患者中水平较高，可随着淋巴结的转移而逐渐升高，TNM分期越高，肿瘤越大，肿瘤数量越多，MIF表达越高，表明MIF可能成为诊断HBV相关原发性肝癌的一项重要指标。

GP73是一种高尔基体特异性Ⅱ型跨膜蛋白，大多数的高尔基体膜蛋白在细胞内运输的过程中，参与蛋白及脂类的修饰反应。GP73具有完整的跨膜结构，由疏水的N-端、膜内区域和膜外的C-端3部分组成。GP73也是早期近侧高尔基复合体的固有膜蛋白，优先在人体的上皮细胞表达[18]，同时，GP73还是诊断HBV相关原发性肝癌和评估术后复发病情的标志物，具有较高的灵敏度和特异度。GP73在良性和恶性肝病患者中的表达均升高，在HBV相关原发性肝癌患者中GP73水平最高，是良性肝病患者的20倍[16]。有研究表明，GP73在正常的肝细胞中不表达或者微量表达，在慢性肝炎或者酒精性肝硬化患者中GP73水平会随着疾病的发展逐渐增加，当肝细胞发生癌变或者携带HBV感染时，GP73血清水平会明显升高[19]。本研究结果显示，GP73在HBV相关原发性肝癌组中的水平明显高于健康对照组，在有淋巴结转移HBV相关原发性肝癌患者中水平较高，随着TNM分期升高、肿瘤变大和肿瘤数量增多，GP73水平也逐渐升高，提示GP73可能参与HBV相关原发性肝癌的发生。

VPIKA-Ⅱ是因维生素K缺乏而诱生的一种异常凝血酶，因为其谷氨酸区域中的一个或者多个谷氨酸残基不能被羧化为γ羧基谷氨酸，所以其不具有正常的凝血酶原功能[20]，同时，γ谷氨酸羧化酶需要在维生素K与低密度蛋白结合下形成复合物，通过肝细胞膜上的特异性受体进入细胞质与γ谷氨酸羧化酶的活化位点相结合，进而形成具有活性的γ谷氨酸羧化酶。HBV相关原发性肝癌细胞不具有正常的细胞膜受体，以及维生素K的缺乏和γ谷氨酸羧化酶的不足是VPIKA-Ⅱ升高的原因，也是形成HBV相关原发性肝癌的原因[21]。本研究结果显示，VPIKA-Ⅱ在HBV相关原发性肝癌患者中呈现高表达，在有淋巴结转移患者中的水平较高，TNM分期的不同，肿瘤大小的不同，肿瘤数量的不同，VPIKA-Ⅱ的水平也不同，因此，VPIKA-Ⅱ可能为检测HBV相关原发性肝癌的一项重要指标。经过Pearson相关分析，MIF与GP73呈正相关，MIF与VPIKA-Ⅱ呈正相关，GP73与VPIKA-Ⅱ呈正相关，说明MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ均在HBV相关原发性肝癌患者的诊断中起着重要作用。

综上所述，MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ在HBV相关原发性肝癌中的水平明显升高，与HBV相关原发性肝癌患者有无淋巴结转移、TNM分期、肿瘤大小和肿瘤数量关系密切，三者均参与HBV相关原发性肝癌的发生，对HBV相关原发性肝癌的诊断具有非常重要的作用。