姜 婷 严晓伟 王建荣

新疆医科大学第五附属医院儿科，新疆乌鲁木齐 830002

哮喘是一种慢性阻塞性气道疾病[1]，儿童哮喘患病率呈逐年攀升趋势[2]。乌鲁木齐市儿童哮喘患病率也逐年上升，从0.61%[3]增加到2010 年1.01%[4]。环境和众多基因共同决定哮喘是目前观点，解整合素-金属蛋白酶33 基因（ADAM33）是通过位置克隆识别的第一批哮喘候选基因之一[5]。多项研究证明汉族哮喘发病与ADAM33 基因S2 相关[6-8]。研究发现转化生长因子-β1（TGF-β1）可促进ADAM33 的表达[9]，这过程通过TGF-β1 激活胞外信号调控激酶实现[10]。乌鲁木齐冬季寒冷漫长，气温日差较大，年降水量稀少，这都是哮喘易感的环境因素[11]。该地区汉族哮喘儿童发病是否与上述研究结果一致，尚不清楚。本研究旨以ERK/TGF-β1 信号通路为基点，研究乌鲁木齐市汉族哮喘儿童ADAM33 基因S2 表达是否受TGF-β1、ERK 影响，为哮喘患儿气道重塑的发病机制深入认识提供证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年7 月—2019 年7 月新疆医科大学第五附属医院及第一附属医院门诊及入院，3～14 岁的汉族支气管哮喘患儿78 例作为哮喘组，选择预防保健科就诊的同期45 例汉族非哮喘儿童作为非哮喘组，两组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。纳入标准：哮喘患儿3 代均为生活在乌鲁木齐1 年以上、互相没有血缘关系，且不是外来的汉族居民。诊断标准：2016 年制订的《儿童支气管哮喘诊断和防治指南》[12]。排除标准：亲属中罹患哮喘的患者，有家族及个人过敏性疾病史，患儿近期有感染的病史，合并肝、肾、心、肺等疾病。经新疆医科大学第五附属医院医学伦理委员会审查同意，家属签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

抽取研究对象外周血4 mL 在含EDTA 的血常规抗凝试管中，保存在-30℃温度，限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术分析ADAM33 S2 基因多态性；血清胞外信号调控激酶（ERK）、TGF-β1 及IgE 水平用酶联免疫吸附分析法测定；引物合成和设计S2 rs号528557，下游引物（R）5’-TGAGAGCCCGAGGAGTG-3’、上游引物5’-GGGGAAC-CGCAGGAGTA-3’（上海捷瑞生物工程有限公司合成）。ADAM33 限制性酶切、特定片段聚合酶链反应（PCR）扩增：DNA 0.5 μL，上下游引物各1 μL，超纯水10 μL，2×TapMasterMix（北京百泰科生物技术有限公司）12.5 μL，共25 μL；PCR 反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃终延伸5 min，共32 个循环，4℃保存。取5 μL PCR产物加入2%琼脂糖凝胶中，在100 V 下电泳35 min，观察结果。酶切反应体系与条件：取PCR 产物10 μL，内切酶BanI（由NEB 公司提供）0.5 μL，1×Buffer 5 μL，加入超纯水14.5 μL，37℃恒温酶切60 min。酶切产物经3%琼脂糖凝胶（EB 染色）电泳35 min，利用紫外线凝胶图像系统观察照像，判定基因型，结果录入数据库。血清TGF-β1、ERK、IgE 水平检测：血清TGF-β1、ERK、IgE水平采用ELISA 测定（试剂盒来自博奥森生物、江莱生物；产品编号：bsk00568、JL10706、JL12745），方法详见说明书。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件对所得数据进行统计分析。计算记录等位基因和基因型频率，基因型分布是否符合Hardy-Weinburg 平衡定律。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。计数资料以例数表示，采用χ2检验。采用直线相关分析ADAM33 S2、TGF-β1、ERK 的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 Hardy-Weinburing 遗传平衡定律

ADAM33 S2 有群体代表性，样本分布达到了H-W遗传平衡（P＞0.05）。见表2。

表2 Hardy-Weinburing 遗传平衡（例）

2.2 基因多态性

2.2.1 ADAM33 PCR 扩增 结果见图1。

图1 ADAM33 S2 PCR 扩增

2.2.2 ADAM33 S2 PCR 产物酶切结果 S2 位点为G/C型，PCR 扩增产物基因片段总长度为458 bp，CC 纯合子时，酶切产物显示458 bp 的条带；GG 纯合子时，酶切产物显示324 bp 和135 bp 的两条条带；CG 杂合子时，酶切产物显示458、135 bp 和324 bp 的3 条条带。见图2。

图2 ADAM33 S2 PCR 产物酶切结果

2.3 两组ADAM33 S2 等位基因和基因型频率比较

两组ADAM33 S2 CC、CG、GG 三种基因型分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时等位基因频率G、C 比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 两组ADAM33 S2 基因型和等位基因频率比较（例）

2.4 两组IgE、TGF-β1、ERK 水平比较

非哮喘组IgE、TGF-β1、ERK 水平低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表4。

表4 两组IgE、TGF-β1、ERK 水平比较（）

表4 两组IgE、TGF-β1、ERK 水平比较（）

注：TGF-β1：转化生长因子-β1；ERK：胞外信号调控激酶

2.5 ADAM33 S2 与TGF-β1 与ERK 相关性分析

Pearson 相关分析显示，TGF-β1 与ADAM33 S2、ERK 呈正相关（r=0.244、0.308，P＜0.05），ADAM33S基因S2 与ERK 无相关性（P＞0.05）。

3 讨论

哮喘是一种异质性疾病[13]，由遗传及环境共同影响所致[14]，目前从基因进行靶向防治成为慢性疾病防治的主要着手点。ADAM33 基因的多态性与儿童哮喘易感性有关[15]。本研究显示ADAM33 S2 可能为乌鲁木齐汉族哮喘儿童的易感基因。究其原因可能为：①影响膜结合生长因子、受体释放；②分解细胞外基质；③增加流动性；④影响细胞与间质细胞基质之间相互作用；⑤促进细胞增殖和分化[16]。

有文献[17]报道，IgE 在过敏体质中水平明显升高，特异性IgE 可经Fc 段与肥大细胞的FcR 受体结合，生成各种炎症因子，如组胺、5-羟色胺等，使机体处于致敏状态；机体再次接触同种过敏原后，会释放大量炎症因子，引起支气管平滑肌痉挛收缩、气道黏膜通透性增加，发生气道高反应，诱导哮喘急性发作[18-19]。本研究显示，非哮喘组IgE 水平低于哮喘组，再次证实儿童支气管哮喘是过敏性疾病，IgE 会促进哮喘发作。

本研究显示，哮喘组TGF-β1 水平高于非哮喘组，差异有统计学意义（P <0.05），ADAM33 S2 与TGF-β1成正相关，提示TGF-β1 可能上调ADAM33 S2 的表达增加哮喘易感性。推测原因：TGF-β1 通过修饰ADAM33基因启动子转录后组蛋白起作用，上调ADAM33 mRNA 表达，促使纤维细胞表达大量的α 平滑肌肌动蛋白向肌纤维母细胞分化，从而促进气道重塑[20]。

本研究显示，哮喘组ERK 水平高于非哮喘组，差异有统计学意义（P <0.05），TGF-β1 与ERK 有相关性，提示ERK 可能上调TGF-β1 的分泌，促进炎症反应和免疫应答，增加哮喘发病风险。气道炎症是引起哮喘反复发作的主要原因[21]，Finlay 等[22]相关实验证实，ERK 信号通路的活化，会促进趋化因子的表达及炎症因子的释放[23]，引起气道持续高反应，最终导致气道重塑[24]，是通过TGF-β1 参与主导肺碱性成纤维生长因子的自分泌实现[24]。研究还显示在抗原反复刺激气道中，高TGF-β1 水平会促使气道重塑、组织纤维化及气道慢性阻塞，最终导致气道不可逆损害[25]。

此外，ERK 与ADAM33 S2 无相关性。可 能为ADAM33 发挥作用是：①影响膜结合生长因子、受体释放；②分解细胞外基质；③增加流动性④影响细胞与间质细胞基质之间相互作用⑤促进细胞增殖和分化[16]，而ERK 发挥作用是TGF-β1 参与主导肺碱性成纤维生长因子自分泌，实现ERK 信号通路的活化，导致气道持续高反应，最终导致气道重塑。两者在促进气道重塑的过程中没有必然的联系，所以ADAM33 S2 与ERK 无相关性。

综上所述，乌鲁木齐汉族哮喘儿童IgE 升高，再次证实哮喘儿童属于过敏性疾病，乌鲁木齐地区儿童汉族哮喘发生的易感基因之一可能为ADAM33 S2。ERK 可能会提高TGF-β1 的表达，TGF-β1 会上调ADAM33 S2 的表达，促进气道重塑，增加哮喘发生的风险。本实验旨在从儿童哮喘关联基因角度出发探讨哮喘的发病机制，研究其上游信号的传导通路，可能为儿童哮喘自基因水平提供理论依据，但因样本数目不够多，仍需更多的样本量来进行下一步的研究，进而实现儿童哮喘预防的精准医疗。