王 丽，冯丽丽，张雨杭，孙亚宁,4，杨继飞，赵 东，王瑞宁，李学伍，郭军庆，张改平,

(1.河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；4.河南百奥生物工程有限公司，河南 郑州 450002； 5.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接触性传染病，流行于世界许多国家，对全球范围内的养猪业造成巨大经济损失[1-3]。世界动物卫生组织(OIE)将此病列为A类传染病[4]，我国也在2012年将其列为优先防治和重点防范的Ⅰ类动物疫病。作为CSF高发国家，我国主要采取接种兔化猪瘟弱毒疫苗的方式来防控CSF，随着该疫苗的长期广泛使用，CSF大规模流行得到有效控制，典型的CSF病例较少出现，但持续性感染、混合感染和隐性带毒等现象多有出现，免疫失败时有发生[5]，给CSF防控工作带来很大挑战。血清学诊断技术可实现对CSFV抗体水平监测，针对性制定合理免疫程序，达到提高疫苗免疫效果的目的，是CSF防控不可缺少的环节，对于防控和净化CSF具有重要的意义。

CSFV的结构蛋白由衣壳蛋白(C)和囊膜糖蛋白(Erns、E1和E2)构成[6]。其中的E2蛋白是CSFV结构蛋白中最重要的免疫功能蛋白，诱导机体产生的特异性中和抗体可抵抗病毒的感染，在保护性免疫反应中发挥关键作用，是研发血清学抗体检测方法的首选靶蛋白[7-8]。Erns蛋白是CSFV的次要免疫相关抗原，机体感染CSFV后也可产生针对Erns的中和抗体，诱导产生的中和抗体同样可以抵抗CSFV强毒的攻击。因此，在诊断方法研制方面，Erns蛋白也具有很大的应用前景[9-10]。目前，Erns蛋白和E2蛋白已在多种表达系统中成功表达，如大肠杆菌[11]、昆虫细胞[12-13]、酵母[14]和植物[15]等。其中，利用大肠杆菌生产重组蛋白，具有产量高、成本低和生产周期短等优点，被广泛用于多种工业产品的生产中[16]。国外研究结果表明，应用Erns和E2融合表达蛋白作为包被抗原较单独的Erns蛋白或E2蛋白ELISA方法可增加血清学诊断的敏感性，更适合免疫后的早期监测及大规模CSFV疫苗普免抗体水平的普查[17]。国内外现已开发出多种适用于规模化养猪场的CSFV抗体监测商品化试剂盒，这些试剂盒的靶标蛋白多为单独的E2蛋白或Erns蛋白，而将E2蛋白和Erns蛋白同时作为靶标抗原建立的抗体检测方法鲜有报道。为此，将以柔性氨基酸接头GSGS串联的Erns蛋白和E2蛋白主要抗原区在大肠杆菌中进行表达，对表达产物进行纯化复性及活性鉴定，并在此基础上建立基于Erns/E2主要抗原区串联表达蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法(Erns/E2-ELISA)，通过对临床样本的检测对该方法的特异性、敏感性及与进口抗体检测试剂盒的符合率进行评价，开展CSFV抗体消长规律研究，旨在为CSFV血清学诊断试剂盒的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及血清E.coliRosetta TM2(DE3)、原核表达载体pET-32a均购自宝生物工程(大连)有限公司；CSFV阳性血清国家参考品(编号Z99)、CSFV阴性血清国家参考品(编号Z100)购自中国兽医药品监察所；兔抗CSFV高免血清、CSFV阳性血清、CSFV阴性血清、猪繁殖障碍呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)阳性血清、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)阳性血清、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)阳性血清、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)阳性血清均为河南省动物免疫学重点实验室制备保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ及质粒提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗猪二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；IPTG、氨苄青霉素(Amp)购自索莱宝科技有限公司；Ni-NTA亲和层析填料(Ni2+柱)购自Novagen公司；BAC蛋白质浓度测定试剂盒购自Thermo公司；脱脂奶粉购自美国Amresco公司；酶标板购自无锡国盛生物工程有限公司；CSFV C株兔化弱毒活疫苗(传代细胞源)购自广东永顺生物制药股份有限公司；IDEXX CSFV抗体检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 供试动物与免疫 选取4头30日龄CSFV抗体阴性的健康仔猪，按照疫苗使用说明接种，用CSFV C株兔化弱毒活疫苗免疫，颈部肌肉深部注射，免疫前采血(0 d)，随后分别在免疫后7、14、21、28、35、42、56 d采集非抗凝血各1份，静置凝集析出血清，分装后-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因合成及原核表达质粒pET-32a-Erns/E2的构建 根据CSFV兔化弱毒C株全基因组序列(GenBank: Z46258.1)设计核酸序列并使用大肠杆菌偏好性密码子对其优化，在序列两端分别加上酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ，含有目的基因的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。设计1对特异性引物F:CGCGAATTCCGGCTAGCCTGCAAGGAAG(EcoRⅠ)，R:CGCAAGCTTCGGAAACATTGAAATTACATG(HindⅢ)用于目的基因的扩增。合成的CSFVErns/E2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pET-32a中，经菌液PCR、双酶切鉴定送样测序，测序结果用DNAStar软件进行分析。将测序正确的阳性质粒转化E.coilRosetta TM2(DE3)感受态细胞，用于重组蛋白表达。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 将重组菌株Rosetta TM2(pET-32a-Erns/E2)和对照菌株Rosetta TM2(pET-32a)表达菌体按1∶100比例分别接种于含50 mg/L Amp的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min 过夜培养活化，将活化菌体按1∶100比例接种于含Amp抗性的LB培养液中，37 ℃、220 r/min培养至OD600为0.6～0.8时，加入0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min振荡诱导，分别于1、2、4、6 h 收获菌体，并将菌体进行超声破碎，确定菌体是否为可溶性表达。

1.2.3 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 收集发酵菌体，超声破碎后12 000 r/min离心20 min得到包涵体，利用包涵体洗涤液(pH值8.0的20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，2 % Triton X-100)反复洗涤包涵体3次。然后加入变性液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0)，于4 ℃搅拌10 h溶解包涵体。4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min，弃除沉淀，可溶上清经0.45 μm滤膜过滤后，利用镍柱进行纯化，纯化方法参照试剂盒说明书。利用SDS-PAGE、Western blot检测重组蛋白纯度。将纯化的蛋白质样品转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)，转膜时间为10 min，转膜结束后，将其置于封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST)中，37 ℃封闭2 h，分别加入以封闭液1∶200稀释的兔抗CSFV阳性血清，37 ℃温育1 h，用PBST洗涤4次，加入1∶1 000 HRP标记的羊抗兔二抗，37 ℃温育1 h，用PBST洗涤4次，AEC显色后观察结果。

1.2.4 包涵体的复性 将纯化的变性包涵体蛋白分4批加入复性液[0.1 mmol/L Tris-HCl， pH值8.0，0.4 mol/L-盐酸精氨酸，2 mmol/L EDTA，5 mmol/L还原型谷光苷肽(GSH)，0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)，0.1 mmol/L NaN3] 中，每次间隔12 h，使复性时间达到60 h，至尿素终浓度为0.5 mol/L。将复性液在4 ℃条件下8 000 r/min离心20 min，取上清，经0.45 μm滤膜过滤后用超滤器浓缩，于pH值8.0的10 mmol/L Tris-HCl中4 ℃透析6次，每6 h换液一次，透析后的蛋白质溶液在8 000 r/min 4 ℃条件下离心10 min，去沉淀留上清，以BCA法测定重组蛋白含量，过滤除菌后小量分装冻存于-20 ℃。

1.2.5 Erns/E2-ELISA检测方法的建立 在96孔板中采用方阵滴定法确定最佳抗原包被质量浓度(0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/L)，CSFV阴性血清和阳性血清稀释倍数(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)，封闭液(5%脱脂奶粉、1%BSA 和1%明胶)封闭1 h，HRP-羊抗猪二抗稀释倍数(1∶500、1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000)，孵育时间(30、60、90 min)，以TMB显色剂显色20 min，测定OD450确定最佳反应条件。

采用优化后的Erns/E2-ELISA方法检测40份CSFV阴性的猪血清样品，每份样品重复3孔，取其平均值，计算总样本OD450的平均值(X)和标准方差(SD)，根据统计学原理，算出临界值X+3SD。当OD450≥X+3SD时，判为阳性；OD450

1.2.6 特异性试验 利用上述建立的Erns/E2-ELISA方法分别对PRRSV、PRV、PCV2、FMDV阳性血清各5份进行检测，同时设置CSFV阴性血清、阳性血清为对照。根据上述已确定的阴阳性临界值判定检测结果，验证所建立的Erns/E2-ELISA方法的特异性。

1.2.7 敏感性试验 分别将CSFV阳性血清国家参考品和CSFV阴性血清国家参考品进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 倍比稀释，利用建立的Erns/E2-ELISA方法检测，确定检测出CSFV阳性血清国家参考品的最高稀释度，以确定其敏感性。

1.2.8 重复性试验 取3份已知的CSFV阳性血清和3份CSFV阴性血清，每份血清样品重复3孔，采用同一批次包被的酶标板，利用建立的Erns/E2-ELISA方法进行批内重复性试验；采用不同批次包被的酶标板，检测上述6份血清样品，每份样品重复3孔，进行批间重复性试验。分别计算变异系数，验证建立的Erns/E2-ELISA检测方法的重复性。

1.2.9 临床样品检测 采用本研究建立的Erns/E2-ELISA方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对121份临床随机采取的血清样品进行检测，分析检测结果，计算建立的检测方法与IDEXX CSFV抗体试剂盒检测结果的符合率。

1.2.10 CSFV抗体消长规律测定 选取30日龄的CSFV抗体阴性的健康仔猪4只，注射CSFV兔化弱毒活疫苗1 mL(1头份/mL)，分别于30日龄(首免前0 d)，首免后7、14、21、28、35、42、49、56 d采血分离血清。利用建立的Erns/E2-ELISA方法检测抗体变化规律，同时用IDEXX CSFV抗体检测试剂盒进行平行对比试验，按其使用说明书进行操作和判断。

2 结果与分析

2.1 Erns/E2原核表达质粒的构建与鉴定

将合成的Erns/E2融合基因克隆至pET-32a载体，构建原核表达质粒，将pET-32a-Erns/E2质粒转化Rosetta TM2(DE3)，并挑取单克隆提取质粒进行酶切及PCR鉴定，电泳结果显示，重组质粒酶切后得到预期的696 bp的目的片段和5 900 bp的载体片段，PCR扩增产物符合预期大小(图1)，初步鉴定为阳性克隆。将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果表明序列正确。

M1.λ-EcoT14 Marker；1.pET-32a-Erns/E2 EcoRⅠ和HindⅢ 酶

2.2 Erns/E2蛋白诱导表达及可溶性分析

将重组菌株Rosetta TM2(pET-32a-Erns/E2)和对照菌株Rosetta TM2(pET-32a)表达菌体在37 ℃用0.5 mmol/L的IPTG分别诱导1、2、4、6 h，收集菌体进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，可观察到在分子质量约43 ku处有明显的蛋白质表达条带，与预计的目的蛋白分子质量接近，且诱导后6 h表达量达到最大(图2)。可溶性分析结果表明，表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。

M.蛋白质分子质量标准；1.未经IPTG诱导的pET-32a；2.IPTG诱导的pET-32a；3.IPTG未诱导的pET-32a-Erns/E2；4—7.pET-32a-Erns/E2 IPTG诱导1、2、4、6 h；8.IPTG诱导pET-32a-Erns/E2 6 h超声上清；9.IPTG诱导pET-32a-Erns/E2 6 h超声沉淀

2.3 Erns/E2蛋白的纯化和Western blot鉴定

将洗涤后包涵体蛋白用8 mol/L尿素溶解，经镍离子亲和层析进一步纯化，纯化后的Erns/E2蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定，在约43 ku附近显现单一条带，与预期大小相符(图3)，纯度约为90%。用CSFV阳性血清对纯化的重组蛋白进行Western blot鉴定，在相应位置处有阳性反应条带(图3)，表明表达的Erns/E2蛋白能够与CSFV阳性血清特异性结合。

M.蛋白质分子质量标准；1.Ni2+纯化的Erns/E2蛋白;

2.4 Erns/E2蛋白的复性效率

经测定和计算，终质量浓度为0.300 g/L的变性纯化蛋白复性后，得到终质量浓度为0.135 g/L的复性蛋白，复性效率大于40%。

2.5 Erns/E2-ELISA检测方法的建立

采用方阵滴定法确定 ELISA最佳反应条件，结果显示，Erns/E2蛋白最佳包被浓度为2.5 mg/L，血清最适稀释倍数为1∶200，此时的P/N值最大。封闭条件以含5%脱脂奶粉的PBST 37 ℃封闭1 h效果最佳；HRP-羊抗猪二抗最佳稀释度为1∶1 000，最佳反应条件为37 ℃孵育1 h，TMB显色20 min。利用建立的Erns/E2-ELISA 法对40份CSFV阴性猪血清进行检测，计算阴性血清OD450平均值X为0.228，标准方差SD为0.034，阴阳性临界值X+3SD=0.33。当待测样品OD450≥0.33时，判为阳性；OD450<0.33时，判为阴性。

2.5.1 特异性试验结果 利用建立的Erns/E2-ELISA方法对CSFV阳性血清、CSFV阴性血清及PRRSV、PRV、PCV2、FMDV阳性血清进行检测，结果显示，只有CSFV阳性血清检测结果为阳性，其余均为阴性(图4)。表明建立的Erns/E2-ELISA法具有良好的特异性。

PS:阳性血清；NS:阴性血清

2.5.2 敏感性试验结果 将CSFV阳性血清国家参考品倍比稀释后，利用建立的Erns/E2-ELISA方法进行检测，结果显示，当阳性血清稀释到1∶12 800时仍为阳性，稀释到1∶25 600后检测为阴性(图5)。可见，建立的检测方法敏感性为1∶12 800，敏感性较好。

PS:阳性血清；NS:阴性血清

2.5.3 重复性试验结果 选取6份不同血清分别进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内最大变异系数为4.22%，批间最大变异系数为5.67%，变异范围均小于10%，表明本试验建立的Erns/E2间接ELISA法具有较好的重复性。

2.5.4 符合率试验结果 分别用建立的Erns/E2-ELISA方法和IDEXX CSFV 抗体检测试剂盒检测121份临床血清样品，结果见表1。由表1可知，Erns/E2-ELISA检测方法的抗体阳性率为66.12%(80/121)，IDEXX CSFV 抗体检测试剂盒的阳性率为62.81%(76/121)。与IDEXX CSFV 抗体检测试剂盒相比，Erns/E2-ELISA方法的敏感性为92.11%(70/76)，特异性为77.78%(35/45)，符合率为86.78%(105/121)。

表1 Erns/E2-ELISA与IDEXX CSFV 抗体检测试剂盒检测结果的对比Tab.1 Comparison of Erns/E2-ELISA and IDEXX CSFV Ab test kit

2.6 CSFV抗体消长规律

利用Erns/E2-ELISA方法检测CSFV疫苗免疫的血清样品，并与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行平行比较，检测结果(图6、图7)表明，Erns/E2-ELISA方法最早可于接种后7 d检测到CSFV抗体，21 d后均为阳性；IDEXX CSFV抗体检测试剂盒最早于14 d检测到CSFV抗体，28 d后均为阳性。2种方法在接种后35～42 d抗体达到最高水平，49～56 d开始趋于稳定。

图6 Erns/E2-ELISA检测接种后CSFV抗体消长规律Fig.6 The dynamics of the antibody of CSFV evaluated by Erns/E2-ELISA after inoculation

图7 IDEXX CSFV抗体检测试剂盒检测接种后CSFV抗体消长规律Fig.7 The dynamics of the antibody of CSFV evaluated by IDEXX CSFV Ab test kit after inoculation

3 结论与讨论

通过CSFV抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证，也是评价CSFV疫苗免疫效果的重要技术手段[17-19]。ELISA方法具有简便、特异、灵敏及结果可靠等优点，是目前国际上承认的唯一适合大规模应用的CSFV抗体检测方法。国外研究结果表明，被CSFV感染的猪血清在分别用Erns、E2蛋白的ELISA检测结果中存在区别，一些在ErnsELISA或Erns多肽ELISA呈阳性反应的血清在E2或E2多肽ELISA中却呈阴性，反之亦然[20]。进一步的研究结果表明，同时含有Erns、E2免疫原区域的嵌合抗原与单独的Erns或E2相比，提高了血清学诊断的敏感性，可最早在感染CSFV 7 d后在猪血清中检测到CSFV抗体，对CSFV的早期诊断具有明显的优势[21]。鉴于国内目前已建立的CSFV抗体ELISA检测方法多为采用单独的E2或Erns蛋白作为包被抗原[22-24]的研究现状，本研究在借鉴前人研究结果的基础上利用原核表达系统高效表达了Erns串联E2蛋白主要抗原区嵌合蛋白，Western blot鉴定结果表明，表达的目的蛋白可被CSFV多抗血清识别，说明融合后的Erns/E2蛋白仍具有生物学活性。将表达的包涵体蛋白经纯化和稀释复性后建立了间接ELISA检测CSFV抗体方法，利用该方法检测CSFV阳性血清国家参考品，敏感性可高达1∶12 800，说明包涵体蛋白经过复性后获得了较高的CSFV抗体结合活性。对临床121份血清样品的检测结果表明，建立的Erns/E2-ELISA检测方法的抗体阳性检出率为66.12%，高于IDEXX试剂盒的62.81%。与 IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比，Erns/E2-ELISA符合率为86.78%，敏感性为92.11%，特异性为77.78%。利用上述2种方法同时评价CSFV C株疫苗免疫的4只30日龄仔猪抗体消长规律，Erns/E2 ELISA和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒分别于免疫后7 d和14 d开始检出阳性，在免疫后35～42 d抗体水平达到高峰，49～56 d抗体趋于稳定。检测结果表明，二者的抗体变化规律一致性较好，Erns/E2-ELISA方法能够和IDEXX CSFV抗体检测试剂盒同时或提前监测到抗体转阳的时间点，敏感性更高，说明建立的检测方法可以用于评价CSFV兔化弱毒疫苗免疫后血清抗体，从而为临床CSFV疫苗免疫程序的制定提供参考。