李 超，杨成敏，高 丽，崔占虎，张超云，黄显章

(1.南阳理工学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473000；2.河南省伏牛山再生资源研究院，河南 南阳 473000； 3.福建农林大学，福建 福州 350002)

艾(ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)为北温带地区特有的菊科蒿属植物，既可食用也可药用，在《名医别录》《食疗本草》《本草图经》等历代本草专著中均有收载[1-3]。食用方面，艾叶在中国、日本、韩国等东亚地区被广泛用作膳食功能材料、食品调味剂、食品着色剂等；药用方面，艾叶既可内服，也可外用，以其所含艾绒为原料制成的灸条是中医灸法的原材料，具有温经止血、散寒止痛等功效，在中医临床应用上效果显著[4-6]。

随着中医药健康体系的快速发展，艾产业的市场需求与日俱增。据本实验室承担的第四次全国中药资源普查(南阳市)统计结果显示，河南省南阳市2019年艾草种植面积达1.4万hm2，艾草企业1 500余家，年销售额达80余亿元，产业规模居全国之首[7]。本实验室前期已对艾草的分类学地位进行了梳理[8]，发现艾草的分布地区广泛，栽培类型较多，其原始种极有可能是由蒿属向南迁徙后，在温带南部至亚热带地区分化、衍生出的适于温暖湿润环境的类群。由于生长环境的特异化，艾草种质资源拥有丰富的变异，尤其是药用部位叶片的表型特征存在较大差异，导致艾草在人工栽培过程中出现种质不清、品种混杂等问题。在实际生产中，种植于同一地区的艾草也存在着若干变种混杂的现象，甚至同时夹杂有五月艾(Artemisiaindica)、水蒿(Artemisiaatrovirens)、野艾蒿(Artemisialavandulaefolia)等混、伪品，严重影响了艾叶的品质和产量，也限制了艾产业的发展和种植效益的提高[9]。

南阳市艾草以人工栽培为主，常见的叶片表型有4种。由于长期重茬耕作、病虫害蔓延、种质混杂及管理不规范等原因，部分种植基地已出现艾叶产量下降、品质降低等问题，优良艾草栽培品种的选育工作亟待开展。到目前为止，国内外学者对艾叶的研究多见于其化学成分和药理作用方面[10-17]，不同表型艾叶的差异分析研究较少，这对艾草优良品种的选育极为不利。因此，开展不同表型艾叶的差异研究对后期艾草品种选育、产量提高及质量提升具有重要意义。除常用的药用成分(如异泽兰黄素、绿原酸及异绿原酸B)外，艾叶中的矿物元素构成及分布特征也不容忽视。矿物元素含量与植物生长发育、营养物质形成以及临床疗效发挥密切相关，是食品和中药材中有效成分不可或缺的构成因子[18-27]。鉴于此，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和高效液相色谱法(HPLC)测定并分析不同表型艾叶中矿物元素和主要药用成分的差异，为艾叶的品质评价和品种选育工作提供有益补充。

1 材料和方法

1.1 供试材料

南阳市艾草常见的叶片表型有4种，具体见图1，分别表示为表型1、2、3、4。其中，表型1艾叶叶片纸质，呈卵形，上表面被灰白色短柔毛，具白色腺点与小凹点，下表面浅绿色，密被蛛丝状柔毛，羽状半裂，裂片卵状椭圆形，叶边缘有疏齿或无，气清香，味苦；表型2艾叶叶片纸质，上表面深绿色，具灰白色短柔毛，具白色腺点，下表面灰绿色，密被柔绒毛，羽状深裂至半裂，裂片椭圆形，气较清淡，味苦涩；表型3艾叶叶片厚纸质，上表面深绿色，具浅灰色柔毛，下表面绿棕色至灰色，短柔毛密而厚，叶片一(至二)回深裂，裂片细长，条状披针形，裂片全缘，气清香特异，味苦涩；表型4艾叶叶片大而厚，呈阔卵形，叶片厚纸质，被厚蛛丝状密绒毛层，羽状深裂，裂片菱状卵形，有2～3枚小裂齿，香气浓烈，味苦微涩。前期研究发现，以上4种表型艾叶的遗传背景相同(经rbcL序列和ITS-2序列鉴定)、遗传性状稳定(已连续观察3代)、农艺参数差异较大，有望进一步选择后申报为不同品种。

1—4：4种不同表型艾草的叶片性状； A：正面性状； a：背面性状

1.2 主要试剂及仪器设备

主要试剂：65%硝酸(优级纯，德国Merk公司)，乙腈、甲醇(均为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，多元素标准溶液(单标/混标，美国Spex公司)，异泽兰黄素对照品(150120)、异绿原酸B(14534613)(成都普菲德生物技术有限公司)，绿原酸对照品(110753，中国食品药品检定研究院)，超纯水(自制)。

主要仪器设备：Thermo X Series-Ⅱ型ICP-MS仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)、Mars-5微波消解系统(美国CEM公司)、Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、ZY-1006超声波清洗机(上海早盈精密清洗机械有限公司)、MS-TS电子分析天平(德国梅特勒公司)。

1.3 试验方法

供试4种不同表型艾草株系群于2017年5—6月在南阳市唐艾生态农业发展有限公司、国医仲景艾草产业园、大艾生态农业发展有限公司等艾草种植基地收集，经南阳理工学院黄显章教授鉴定，均为菊科蒿属植物艾(Artemisiaargyilevl.et Vant.)。同年7月，分别将其地下匍匐茎种植于南阳理工学院药用植物园艾草种质圃中，即挖取不同表型艾草种质地下未出苗根状茎，截成15～20 cm小段后种植，每种表型株系群种植60～80份，设置3个小区，各试验小区长2.0 m、宽1.5 m，株行距为30 cm×30 cm，小区之间开深沟做高畦，并用深入地面的木板隔开防止艾地下根状茎混杂，试验材料的立地条件及田间管理一致。2019年6月上旬，于艾草等高90 cm时分别采收艾叶样品，不同表型艾草的艾叶样品均采自第2或第3茎节处，重复3次，并进行去杂、干燥、剪碎、混匀后备用。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 35种矿物元素含量 样品消解：准确称取艾叶样品约0.4 g(精确至0.000 1 g)于消解内罐，加5 mL 65% HNO3浸泡过夜，160 ℃保持6 h，冷却，赶酸，移入25 mL容量瓶中，合并洗液，1% HNO3定容，混匀备用，同时做试剂空白试验。 ICP-MS工作参数：雾化器压力为1.0 Bar，辅助气流量为0.7 L/min，RF功率为1 200 W，等离子气(氩气)流量为13 L/min，蠕动泵转速为分析30 r/min+冲洗70 r/min。

1.4.2 异泽兰黄素、绿原酸、异绿原酸B含量 供试品制备：精密称取过筛(孔径为0.25 mm)后的不同表型艾叶粉末约0.5 g于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声提取40 min，放凉，缓慢滴加60%甲醇补足减失的质量，混合均匀，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

色谱条件：流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱为0～15 min 10%～20%B,15～30 min 20%B,30～40 min 20%～40%B,40～50 min 40%～50%B,50～55 min 50%～90%B,56～60 min 90%B；流速为0.8 mL/min；柱温为20 ℃；检测波长为340 nm。

1.5 数据分析

采用SPSS 19.0软件和SIMCA-p 12.0软件对测定数据进行方差分析、主成分分析、因子分析等。

2 结果与分析

2.1 不同表型艾叶中矿物元素含量的差异分析

2.1.1 矿物元素含量特征 分别对4种表型艾叶的矿物元素含量进行测定和分析，结果见表1。从表1可以看出，不同表型艾叶矿物元素含量差异较大，总体上各元素含量表现为K>Ca>Mg>Al>Fe>Mn>Na>Cu>Sr>Zn>Ba>Ti>Cr>Ni>V>Mo>La>Pb>Zr>As>Y>Co>Cd>Sc>Sn>Ga>Nb>Tl>Sb>Bi>Be>Ge>Ag>Hg>Se，元素含量的数量级介于10-6～102g/kg，变异系数介于10.06%～51.50%，属于弱至中变异性。

其中，Na、Mg、K、Ca、Mn、Fe、Ni、Zn及Mo等元素是植物生长和发育所必需的元素，具有调节细胞生理活动、参与细胞内信号转导等功能。表型2艾叶Ca含量最高，为15.503 g/kg，显著高于表型3艾叶(8.661 g/kg)，但与表型1和表型4差异不显著；表型1艾叶Mn含量最高，为138.213 mg/kg，显著高于表型3艾叶(91.611 mg/kg)；表型4艾叶Zn、Mg含量最高，分别为43.578 mg/kg、5.035 g/kg，均显著高于表型3艾叶；表型2艾叶Fe含量最高，为0.833 g/kg，显著高于其他表型艾叶；Na、Ni含量以表型1艾叶最高，分别为73.642、2.899 mg/kg，均显著高于其他表型艾叶；而K、Mo含量以表型2艾叶最高，平均含量分别为39.519 g/kg、1.151 mg/kg，但表型间差异均未达到显著水平。

As、Cd、Hg、Cu、Pb是重金属和有害元素，不同表型艾叶以表型2艾叶Pb含量最高，为1.073 mg/kg，显著高于表型3艾叶(0.593 mg/kg)，但与表型1和表型4差异未达到显著水平；Cu、Cd含量以表型4艾叶最高，分别为47.218、0.218 mg/kg，均显著高于表型3；As和Hg含量以表型2艾叶最高，分别为0.663 mg/kg和13.544 μg/kg，显著高于其他表型艾叶。参照国家药典标准[28]，Pb、Cd、As、Hg含量均在安全水平，而Cu含量超出限度2倍以上，这可能与艾叶对Cu元素的富集能力较强有关。通过上述分析可以看出，表型2和表型4艾叶的有害元素含量均较高，应予以关注。另外，本试验还测定了其他多种矿物元素，尤其是过渡元素和稀土元素，既可为不同表型艾叶的品质评价提供科学依据，也可为艾叶表型间的差异化鉴别提供有益参考。

2.1.2 矿物元素含量的主成分分析 主成分分析是采用降维的方式将原始多个变量重新组合成一组新的相互无关的少数几个综合变量，但能够尽可能多地反映原始变量的信息。为探索不同表型艾叶矿物元素间的因子关系，采用SPSS 19.0软件和SIMCA-p 12.0软件进行特征值的提取及累计方差贡献率的计算，分析结果见表2。

由表2可知，对不同表型艾叶矿物元素含量共提取4个主成分，累计贡献率高达94.375%，说明所提取的4个主成分能够较为全面地反映矿物元素的整体特征。其中，第1主成分的特征值为24.532，解释原始数据变量信息的70.092%，K、Ca、Mg、Al、Fe、Mn、Na、Cu、Sr、Zn、Ba、Ti、V、La、Pb、Zr、As、Y、Co、Cd、Sc、Sn、Nb、Ga、Tl、Be、Bi、Ge、Ag、Hg及Se等31种元素具有较高的载荷值(均大于0.6，且在不同因子间最高)，说明以上元素对第1主成分的贡献率较大；第2主成分的特征值为3.869，方差贡献率为11.055%，Mo和Sb元素具有较高的载荷；第3主成分贡献率为9.485%，特征值为3.320，Cr和Ni元素的载荷值较高；而元素在第4主成分中的载荷普遍较低，可视为前3个主成分变量信息的补充，方差贡献率为3.743%。

2.1.3 矿物元素含量的因子分析与评价 以各主成分因子载荷(F1—F4)与方差贡献率乘积之和相加，得出不同表型艾叶总因子评价函数F=0.700 9F1+0.110 6F2+0.094 9F3+0.037 4F4，因子综合得分及排名详见表3。从表3可以看出，表型2和表型1艾叶样品得分相对较高，排名较为靠前，分别在第1、3、5位和2、4、6位，2种表型艾叶排名存在交叉；表型4和表型3艾叶样品得分相对较低，排名较为靠后，分别在第7、8、9位和10、11、12位。以上结果表明，基于矿物元素积累与分布的角度考虑，表型1和表型2艾叶的品质优于表型3和表型4艾叶。

表3 主成分因子载荷及评价Tab.3 Loading and evaluation of principal component factors

续表3 主成分因子载荷及评价Tab.3(Continued) Loading and evaluation of principal component factors

2.2 不同表型艾叶中主要药用成分含量的差异分析

采用HPLC法测定4种不同表型艾叶的异泽兰黄素、绿原酸及异绿原酸B含量，结果见表4。从表4可以看出，3种药用成分含量在不同表型艾叶间差异显著，其中，表型1艾叶异泽兰黄素含量最高，为3.01 mg/g，与表型4艾叶差异不显著，但显著高于表型2、表型3艾叶；表型1、表型3艾叶绿原酸含量相对较高，分别为3.56、4.59 mg/g，显著高于表型2和表型4艾叶；异绿原酸B含量以表型1、表型3艾叶相对较高，分别达到4.91、5.10 mg/g，两者差异不显著水平，但均显著高于表型2艾叶。基于以上3种药用成分综合考虑，表型1艾叶优于其他表型艾叶。

表4 不同表型艾叶中异泽兰黄素、绿原酸及异绿原酸B的含量Tab.4 Contents of eupatilin,chlorogenic acid and isochlorogenic acid B in different phenotypes of A.argyi

3 结论与讨论

本研究采用ICP-MS法和HPLC法分别测定南阳不同表型艾叶中Be、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Ba、La、Hg、Tl、Pb、Bi 等35种矿物元素含量及异泽兰黄素、绿原酸、异绿原酸B的含量，并进行多元分析和综合评价，为南阳艾叶的品质评价和品种选育提供有益参考，具有重要的现实意义。

本研究结果表明，所建立的35种矿物元素测定方法和3种主要药用成分测定方法线性关系良好，精密度、重复性和稳定性均较高。不同表型艾叶中矿物元素含量差异较大，元素变异系数在10.06%～51.50%，属于弱至中变异性。在植物生长的必需元素中，表型2艾叶Ca含量最高，显著高于表型3；表型1艾叶Mn含量最高，显著高于表型3；表型4艾叶Zn和Mg含量最高，均显著高于表型3；表型2艾叶Fe含量最高，显著高于其他表型；表型1艾叶Na和Ni含量最高，均显著高于其他表型；而表型2艾叶K和Mo含量最高，但在表型间差异均不显著。在重金属和有害元素中，表型2艾叶Pb含量最高，显著高于表型3；表型4艾叶Cu和Cd含量均最高，均显著高于表型3艾叶；As和Hg含量均以表型2艾叶最高，显著高于其他表型艾叶。在国家药典委发布的《药材和饮片检定通则公示稿(2019)》中明确规定了以上5种元素的限度要求，即As含量≤2 mg/kg，Cd含量≤1 mg/kg，Hg含量≤0.2 mg/kg，Cu含量≤20 mg/kg，Pb含量≤5 mg/kg，参照国家药典标准，Pb、Cd、As、Hg 4种元素含量均在安全水平，而Cu元素含量超出限度。不同表型艾叶矿物元素评价函数为F=0.700 9F1+0.110 6F2+0.094 9F3+0.037 4F4，计算结果表明，表型1和表型2艾叶得分相对较高，表明基于矿物元素角度考虑，表型1和表型2艾叶品质较好。

在主要药用成分分析中，异泽兰黄素、绿原酸、异绿原酸B 3种药用成分含量在不同表型艾叶间差异显著。表型1艾叶中异泽兰黄素含量最高，表型1和表型3艾叶中绿原酸和异绿原酸B含量相对较高，且与其他表型艾叶的差异显著。基于矿物元素和药用成分综合考虑，在今后艾草栽培选择上，可优先考虑表型1艾草。

本研究为探索不同表型艾叶中矿物元素及药用成分的分布特征提供了数据支撑，也为艾叶的品质评价和品种选育提供了有益参考。下一步考虑将矿质元素与更多有机成分结合进行更为深入的研究。