孟江玲，何 德，李翠新

(西南林业大学 生命科学学院,云南 昆明 650224)

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)]又称北虫草、北冬虫夏草、蛹草菌等，隶属虫草菌科(Cordycipitaceae)、虫草属(Cordyceps)[1]。虫草的主要食药用成分包含核苷类、多糖类、糖醇和甾醇类、蛋白质及氨基酸和多肽类、无机元素类及其他物质[2]。虫草多糖是蛹虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，具有提高人体免疫能力、改善呼吸系统、促进肾上腺素分泌、抑制肿瘤生长等功效[3]；虫草多糖也是综合评价蛹虫草品质的指标之一[4]。

铜(Cu)是人体的必需微量元素[5-12]，在体内不能合成,必须由外界摄入[13]。人体每日摄入量过高或过低都对健康有害，引发各种疾病，如免疫功能下降、糖尿病、肿瘤、骨质疏松、肝硬化以及癌症等[14-16]。食用菌能够富集重金属离子，且富集能力超过绿色植物[17-22]。目前，已有学者研究了金属铜离子对蛹虫草菌丝抗氧化酶活性和Cu2+耐受度的影响[22]，并没有考虑蛹虫草富集铜离子后对其子实体生长及食用富铜蛹虫草后对人体健康的影响。鉴于此，将铜离子添加到培养基中后检测蛹虫草子实体中的铜离子含量，将其与人体代谢耐受的最低值和最高值作比较，评估培养基中铜离子添加量对蛹虫草自身及人体健康的影响，为蛹虫草开发利用提供研究基础，同时为人们直接和间接利用蛹虫草提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

试验材料来自西南林业大学食用菌栽培与利用实训基地和大学生创新创业食用菌资源保护与开发利用推广中心。

试剂：标准铜溶液1.0×10-4mol/L、蒽酮试剂[23]、KBrO3溶液0.03 mol/L、罗丹明B溶液2.5×10-4mol/L、抗坏血酸溶液0.01 mol/L、H2SO4溶液0.20 mol/L、标准葡萄糖溶液0.1 mg/mL。

1.2 培养基制备

PD液体培养基：土豆200 g、葡萄糖15 g、淀粉5 g、蛋白胨5 g、酵母膏3 g、硫酸镁1 g、磷酸二氢钾1 g，蒸馏水定容到1 L，自然pH值[22-24]。

PDA固体培养基：在PD液体培养基配方基础上添加10 g/L的琼脂。

PD液体加铜离子培养基：在PD液体培养基配方基础上，按照0、1.6、3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、32.0 mg/L质量浓度梯度添加铜离子溶液[25-26]。

大米加铜离子培养基：大米30 g、营养液55 mL(葡萄糖9.1 g、蛋白胨3.6 g、酵母膏3.6 g、硫酸镁1 g、磷酸二氢钾1 g、水1 L)，并按照上述质量浓度梯度添加铜离子溶液。

1.3 菌丝体培养和出草试验

通过PDA固体培养基斜面活化菌种后，转至PD液体加铜离子培养基，于25 ℃、150 r/min的恒温摇床培养8 d。

菌种通过PDA固体培养基斜面活化后，挑取0.5 cm2菌块1～2块至PD液体培养基，于25 ℃、150 r/min的恒温摇床培养，制得种子液。将种子液接种到大米加铜离子培养基中，每个处理组3瓶，重复3次，进行出草试验[26-28]。

1.4 蛹虫草生长及产量测定

菌丝液体培养8 d，滤去液体培养基，置于培养皿中在45 ℃的鼓风恒温干燥箱中烘50 h，记录恒质量值即可。

子实体采摘时称质量，将其置于45 ℃鼓风恒温干燥箱中烘干水分(4～5 d)，记录恒质量。

1.5 菌丝体、子实体中多糖和铜离子含量测定

利用蒽酮比色法[23]和罗丹明法[29]分别测定菌丝和子实体中多糖及铜离子含量。

1.6 人体每日食用富铜蛹虫草量的计算

中国营养学会建议的人体铜摄入量是2.0～8.0 mg/d[30]。安全起见，本研究取最小值2.0 mg/d作为最适铜摄入量，计算需要摄入的蛹虫草干品的量。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草生长及产量

从图1可以看出，蛹虫草菌丝体在没有添加铜离子的培养基里，生长状态良好，厚薄均匀。加入铜离子后，蛹虫草菌丝体的菌落中间部位菌丝较为密集，微微泛黄；边缘菌丝稀疏，白色。表明蛹虫草菌丝体生长会受到铜离子的影响。菌丝体干质量和生长速度等在不同铜离子添加量时存在显著性差异(表1)。

1：0 mg/L；2：1.6 mg/L；3：3.2 mg/L；4：6.4 mg/L；5：12.8 mg/L；6：19.2 mg/L；7：25.6 mg/L；8：32.0 mg/L

在培养基中添加铜离子后，蛹虫草子实体发生退化，出现分叉、矮小、丛簇等形态的变化(图2)。蛹虫草子实体的高度和直径随着铜离子添加量的增加而减小(表2)，说明培养基中加入铜离子使子实体形态发生退行性变化，而且最小铜离子添加量1.6 mg/L已经影响了蛹虫草子实体的生长，导致蛹虫草的退化。由表3可知，添加铜离子的培养基中生长的蛹虫草子实体鲜质量与干质量均小于空白组。说明本研究中最小铜离子添加量1.6 mg/L时已经开始影响蛹虫草子实体生长。

表1 不同铜离子添加量对蛹虫草菌丝体干质量、铜离子含量及多糖含量的影响

a.0 mg/L; b.1.6 mg/L; c.3.2 mg/L; d.25.6 mg/L图2 不同铜离子添加量下蛹虫草子实体形态特征

表3 不同铜离子添加量对蛹虫草子实体质量、铜离子含量及多糖含量的影响

续表3 不同铜离子添加量对蛹虫草子实体质量、铜离子含量及多糖含量的影响

2.2 菌丝体、子实体中多糖和铜离子含量

利用蒽酮比色法测得标准葡萄糖溶液质量浓度与吸光值关系(图3)，获得线性回归方程：A=32.671B-0.002 5(R2=0.999 1)，A表示吸光值，B表示葡萄糖质量浓度。

图3 葡萄糖溶液标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose solution

采用罗丹明法测定铜离子质量浓度与吸光值关系(图4)，获得线性回归方程：Y=0.269 9X+0.000 3(R2=0.999 8)，Y表示吸光值，X表示铜离子质量浓度。

图4 铜离子溶液的标准曲线

根据表1可以得出，蛹虫草菌丝体多糖含量随着铜离子添加量增加而增加；菌丝体铜离子富集率先增加后减少，在铜离子添加量3.2 mg/L下达到最大值54.41%，从铜离子添加量19.2 mg/L开始不富集铜离子，说明在培养基中添加少量且适量的铜离子有助于提高菌丝体铜离子富集率。

根据表3可知，不同处理蛹虫草子实体多糖含量存在显著性差异，子实体多糖含量随着铜离子添加量增多而增加，在32.0 mg/L的铜离子添加量时子实体多糖含量最多，说明添加铜离子可促进蛹虫草子实体合成多糖。蛹虫草子实体铜离子富集率呈现M形趋势，即先增后减又增再减趋势，在质量浓度3.2 mg/L和25.6 mg/L下分别出现高峰，在12.8 mg/L的质量浓度下甚至还低于空白对照的情况。其中，蛹虫草铜离子添加量为3.2 mg/L时，子实体的铜离子富集率为191.01%。

2.3 蛹虫草子实体铜离子含量与人体每日摄入铜离子的限定值对比

综上，本研究发现，最适宜的铜离子添加量为1.6～3.2 mg/L,但最小铜离子添加量1.6 mg/L已造成子实体发生退化等情况。因此，仅在1.6 mg/L铜离子添加量的情况下探讨额外添加铜离子的子实体满足人体摄入铜离子的情况。该添加量下，子实体含铜离子(0.068±0.003)mg/g，约是空白组的2倍。在此情况下，只需每天食用29 g干蛹虫草或116 g鲜蛹虫草(根据鲜质量/干质量比约为4进行换算)就能补足人体所需铜离子量，但是不宜超过117 g干蛹虫草或468 g鲜蛹虫草。

3 结论与讨论

铜是真菌生长必需的金属元素，是生物体内许多酶的金属辅基，但是铜过量会对真菌产生毒害作用。本研究表明，1.6 mg/L的铜离子添加量已经对蛹虫草菌丝体造成一定损害，出现生长不均匀等情况。而何卓晶等[22]研究发现，当Cu2+超过300 mg/L时，会严重影响菌丝体的生长，菌丝体产量明显低于空白对照组，该质量浓度高于本研究得出的影响菌丝体的最小铜离子添加量1.6 mg/L。但总体结果都表明，高浓度的Cu2+抑制菌丝体的生长。因此，本研究所用菌种需在1.6 mg/L以下的铜离子添加量下研究其生理生化情况，找到适宜的铜离子添加量。

市面上蛹虫草子实体大多以鲜菌或者干菌等方式出售，其形态应是直立生长、无畸形。而本研究铜离子最小添加量1.6 mg/L已经造成蛹虫草子实体退化，出现分叉、矮小、丛簇等形态的变化。因此，选择1.6 mg/L铜离子添加量为试验中子实体最佳生长质量浓度。

蛹虫草子实体铜离子富集率呈现M形曲线，而在其他真菌铜离子富集的研究中如香菇[31]、平菇[32]等，铜离子富集率均随着铜离子浓度增加而增加，未见到富集率低于空白对照的现象，其原因待进一步研究。

卢娇娇[18]研究发现，随着培养基中铜离子添加量增加(500～1 000 mg/kg)，平菇子实体铜离子含量也增加，最大铜离子含量为0.022 59 mg/g，需食用88 g才能满足人体所需铜离子量。自然情况下草菇中铜离子含量最高为0.057 81 mg/g，其次是双孢菇(0.054 4 mg/g)[33]，均小于本研究铜离子添加量1.6 mg/L下的蛹虫草铜离子含量(0.068 mg/g)。因此，本研究的富铜离子蛹虫草更适合作为人们补充铜离子的食药菌。虽然在该质量浓度下子实体多糖含量、铜离子含量都比空白对照增加不少，铜离子富集率较高，但是其形态有部分退化现象。因此，仍然需要改进铜离子添加的浓度梯度，探索较低浓度铜离子对子实体生长的影响，致力于找到既能促进子实体生长，又能增加铜离子含量的浓度。